研究背景：　　随着癌症发病率和死亡率逐渐的增加，癌症已经成为威胁生命最常见的疾病之一。目前，治疗癌症的方法包括化学疗法，外科手术治疗，放射性治疗等。传统的治疗方法主要缺陷是生物药物的非特异性，对正常的其他器官组织产生了严重的副作用,且易产生耐药性。因此开发具有不同作用机制的新型抗肿瘤药物是克服耐药性的主要挑战之一。　　查尔酮（1,3-二芳基-2-丙烯-1-酮）是黄酮类化合物的天然中间体。查尔酮具有广泛的生物活性，包括抗氧化，抗菌，抗真菌，抗HIV，抗利什曼虫病，抗丝虫病，抗疟，抗炎和抗肿瘤等生物活性。许多查尔酮衍生物通过不同的分子机制对癌细胞产生细胞毒性作用，已经被证实其具有一定的抗肿瘤活性。　　吡唑啉类化合物因其独特的母核结构具有广泛的抗肿瘤活性。尽管更广为人知的是它们在止痛、退热和消炎方面的作用，吡唑啉也可以有抗白血病，抗肿瘤和抗增殖的作用。虽然吡唑啉母核骨架是介导其生物效应的重要组成部分，但外周取代基的类型对其靶向选择性至关重要。构效关系的研究表明，该化合物的细胞毒性作用很大程度上依赖于芳环上的取代类型和模式。3,4-二取代吡唑啉衍生物和3-(咪唑-2-基)-4-[2-(吡啶-3-基)乙烯基]-吡唑啉已经被报道为细胞依赖性激酶 (CDK) 抑制剂，并已被证明具有抑制人多种肿瘤细胞体外增殖的作用。目前处于临床三期实验的达马莫德 (BIRB-796)是一种丝裂原活化蛋白激酶 (p38α MAPK) 抑制剂，它是具有吡唑啉结构的抗肿瘤活性物质。另外临床上一直在使用的含有吡唑啉结构的阿昔替尼 (N-甲基-2-[3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲哚-6-基磺酰]-苯甲酰胺) 是由辉瑞研发的一款靶向肾癌的分子药，主要作用的靶点是VEGFR1, 2, 3, PDGFR, c-KIT，临床上主要用于之前接受过一种细胞因子或酪氨酸激酶抑制剂治疗失败的进展期肾细胞癌 (RCC) 的成人患者，等等。但是，目前临床上使用的含有吡唑啉母核的抗肿瘤药物还是少之又少，因此本课题的研究方向着重于对吡唑啉母核的结构改造和修饰，以期探寻出新的抗肿瘤药物。　　研究目的：　　本实验主要在前期实验室查尔酮结构与设计合成的基础上设计合成具有不同性质取代基的吡唑啉衍生物，并用人肝癌细胞 (HepG-2)、人肺癌细胞 (A549)、人宫颈癌细胞(HeLa)、人卵巢癌细胞(A2780)以及正常的小鼠胚胎成纤维细胞 (NIH/3T3) 进行细胞体外毒性实验。评估母核结构上不同取代基对各自抗肿瘤活性的影响，并初步探索其抗肿瘤的机制，筛选出抗肿瘤效果最优，最具有良好选择性的化合物，并为后续的化合物的结构设计和进一步的研究提供理论参考依据。　　研究方法：　　(一)合成部分　　(1) 用含不同取代基的苯乙酮和不同取代基的苯乙醛为原料，通过C la isse n-Sc hmid t缩合反应合成不同取代基的查尔酮衍生物。　　(2) 查尔酮衍生物和氨基硫脲反应，得到不同取代基的2H-吡唑啉衍生物；或者查尔酮衍生物和4-氟苯肼盐酸盐或2-氟苯肼盐酸盐反应，生成不同取代基的吡唑啉衍生物。　　(3) 将上述反应得到的2H-吡唑啉类化合物与2-溴苯乙酮反应，得到含有不同取代基的吡唑啉-噻唑衍生物。　　(二) 药理部分　　(1) 采用M TT (3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐) 法测定各吡唑啉衍生物的体外细胞毒性实验，计算出相应的IC 5 0值，筛选出体外抗肿瘤活性较好且选择性较好的目标化合物。　　(2) 细胞平板克隆形成实验，评价目标化合物作用于肿瘤细胞后，是否可以减少肿瘤细胞形成的克隆数目及大小，从而计算目标化合物对肿瘤细胞克隆形成的抑制率。　　(3) 细胞周期实验，检测吡唑啉类的目标化合物对肿瘤细胞 DNA的合成不同时期的影响，初步探讨目标化合物作用于细胞周期的机制。　　(4) 细胞凋亡实验；　　①通过不同的荧光染料对细胞进行染色，进行原位荧光显微镜检测；观察细胞被染色的情况，为后续的双染凋亡实验摸索最佳的染色时间和染料用量；　　②通过Annexin V-FITC和PI双染后，流式细胞仪上机检测，初步观察目标化合物诱导细胞凋亡的状况。　　(5) 利用蛋白免疫印迹法Western blot实验，通过蛋白质的表达情况，分析目标化合物对肿瘤细胞的蛋白表达情况的影响，探索药物诱导肿瘤细胞凋亡的可能通路。