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在脊椎动物的发育过程中,原肠期是一个非常重要的时期,胚胎通过原肠期的发育开始出现3个胚层命运的分别,并产生首尾轴和背腹轴的极性。本实验室的鱼类克隆研究表明,能否完成原肠化（即能否到达胚孔封闭期）对于克隆胚胎的后续存活有着指标性的意义。本研究拟采用噬菌体展示技术,以斑马鱼为模型,鉴定和研究原肠胚发育相关的基因,获得的具体进展如下：1)以斑马鱼胚孔封闭期胚胎匀浆液作为靶分子,淘选经斑马鱼30%外包期胚胎匀浆液预吸附后的小鼠单链抗体文库,得到与胚孔封闭期匀浆液有较高结合力的单链抗体6类。选出出现频次最高的两类单链抗体scFv1和scFv2,对其结构进一步分析,作为后续研究的靶分子。经过序列分析、ELISA鉴定和免疫学的分析,发现它们是两类完全不同的小鼠单链抗体。2)构建出符合要求的斑马鱼胚孔封闭期胚胎的T7噬菌体cDNA展示文库。经测定,所构建的原始文库滴度为1.72×107pfu/ml。扩增后文库的滴度为4.6×1011pfu/ml。文库重组率为99.1%,重组体中插入片段长度范围主要在250bp和1500bp之间,与实验设计相符。3)交替使用两种靶分子（抗Etag抗体与单链抗体复合物和未经纯化的单链抗体）,对所构建的斑马鱼胚孔封闭期胚胎T7噬菌体cDNA展示文库进行淘选,获得与单链抗体结合的噬菌体克隆。对这些克隆所包含的cDNA序列所编码的多肽特征进行比较分析,我们推测单链抗体和噬菌体展示多肽之间主要通过空间构象相互识别、两者的结合可能涉及到分子间的离子键。与单链抗体scFv1结合的8种噬菌体克隆的插入序列,2种只能找到同源的基因组序列,其余6种都可以找到同源基因序列：酪蛋白激酶（Casein kinase1）、 beta-Catenin、染色质装配因子1亚基A （Chromatin Assembly Factor1Subunit A,CAF-1）、核仁素（Nucleolin）、核糖体蛋白L10（Ribosomal protein L10）、豆蔻酰化的富含丙氨酸的蛋白激酶底物（Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate, MARCKS）。与单链抗体scFv2结合的2种噬菌体的插入序列分别与核糖体蛋白L35和L7a有高度同源性。对所获得的目的cDNA克隆进行胚胎整体原位杂交表达分析,结果显示除scFvl-21克隆之外,其它cDNA克隆所对应的基因在原肠期均呈现泛表达特征。4)鉴于scFv1-21克隆所对应的基因在原肠期呈现显著的区域表达特异性,我们对其进行了进一步的研究。其cDNA片段编码斑马鱼的Marcks蛋白,序列分析和生物信息学研究发现,该基因定位于斑马鱼第17号染色体上,含有两个外显子,中间为一个820bp的内含子。克隆的cDNA全长为1823bp,其中开放阅读框为684bp,编码227个氨基酸残基的蛋白质,预测的分子量约为23.2kDa,与报道的已知MARCKS蛋白同源性在40%左右。在斑马鱼Marcks蛋白分子中,也存在三个序列保守区域：①位于氨基端的豆蔻酰化位点；②介导内含子剪切位点：③磷酸化位点。斑马鱼Marcks蛋白的等电点为4.56,属于一种酸性蛋白质。氨基酸残基的组成特异：丙氨酸含量高达23.3%,谷氨酸含量为21.1%,赖氨酸含量为12.3%。原位杂交分析显示该基因在早期胚胎中的表达具有显著的时空特异性：在原肠期,其表达区域主要集中于神经外胚层区域,在后续发育时期,特异地表达于各类神经组织细胞中,推测斑马鱼marcks可能参与胚胎发育早期发育过程。5)此前的研究表明,MARCKS的功能涉及到多种生物过程,如,大脑的发育、细胞迁移,细胞分化,细胞之间的相互作用、神经内分泌和肿瘤抑制等。在爪蟾中,编码MARCKS相似蛋白的基因可能参与体轴的形成和中枢神经系统的发育。在本实验中,我们利用morpholino技术敲落marcks基因的表达后,胚胎出现背部化表型。共注射p53和marcks的MO证实敲落所产生的表型是特异的。标记基因的分析显示,敲落内源性marcks的表达,导致胚胎发育过程中神经外胚层和中胚层的命运背部化。注射体外转录的marcks mRNA到斑马鱼胚胎后,胚胎呈现轻度腹部化表型：头部减小,躯体后部出现增大的血岛；且腹部因子表达增加,表达区域扩展至背侧。接下来,对Wnt/beta-Catenin信号通路的下游因子在marcks过表达和表达敲落胚中的表达变化情况的进行分析,提示marcks基因可以正向调节Wnt信号通路转录活性,进而参与到胚胎发育的背腹轴建成。过表达marcks的胚胎内血液组织过度发育,血液组织的标记基因表达增加；敲落marcks的表达后,血液组织丧失,标记基因无表达。以上结果提示,斑马鱼marcks可能作为Wnt信号通路的一种正向调控因子,参与到胚胎背腹轴的形成,以及血液组织的发育。在本研究中,我们希望将噬菌体展示技术高通量、操作简便、容易扩增、基因型和表现型相结合等优点应用到发育生物学的研究中去,为在蛋白水平分析胚胎发育的机制提供新的技术。作为一个探索性的研究而言,我们目前所取得的结果与预期尚存在一定距离,但是为这种新的思路提供了第一次有益的尝试并积累了宝贵的经验,为进一步的研究打下了基础。