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植物乳杆菌是一种重要的益生菌,具有较强的产酸和耐酸能力。但植物乳杆菌发酵产品在储存期间仍然在持续产酸,该过程发生的后酸化现象,明显影响了产品的口感和保质期,不利于产品的销售。大量研究表明,H~+-ATPase是乳酸菌生长产酸的关键酶,能够调控乳酸菌胞内pH的平衡,但具体的调控机制仍鲜有报道。本课题以植物乳杆菌ZUST为亲本菌,诱变筛选得到两株H~+-ATPase活性减弱的突变菌。分别对亲本菌和突变菌的生长产酸性能、葡萄糖代谢速率、乳酸产量以及酶活力进行测定。然后确定突变菌的具体突变位点,并对H~+-ATPase的基因表达水平进行测定,鉴定出H~+-ATPase调控机制中的关键基因,进一步探索突变菌H~+-ATPase活性减弱的根本原因。本文的主要工作和结果如下:1.以植物乳杆菌ZUST为亲本菌,利用硫酸新霉素成功诱变并筛选得到两株H~+-ATPase活性减弱的突变菌ZUST-1和ZUST-2。2.分别测定亲本菌ZUST和突变菌ZUST-1、ZUST-2的生长产酸能力、葡萄糖代谢速率、乳酸产量和H~+-ATPase活力变化情况。结果发现,突变菌ZUST-1比亲本菌ZUST的生长产酸能力在对数期略低,进入稳定期后基本相近,24 h时OD660为1.5,pH为3.7。葡萄糖代谢速率和乳酸产量差异也较小,进入稳定期后基本相同,24 h时葡萄糖浓度为3.6 g/L,乳酸浓度为19.3 g/L,H~+-ATPase活力比亲本菌下降了10.1%。而突变菌ZUST-2的生长产酸能力最弱,24 h时OD660为0.8,pH为4.0。葡萄糖浓度为6.2 g/L,乳酸浓度为14.8 g/L。H~+-ATPase活力比亲本菌下降28.8%。3.为确定突变菌具体的突变位点,将亲本菌和突变菌的H~+-ATPase分别克隆并测序。结果发现,突变菌ZUST-1和ZUST-2的atpA基因上均有22个碱基位点发生突变,突变菌ZUST-2的atpC基因上有6个碱基位点发生突变。通过氨基酸序列和蛋白质三维结构分析,发现突变菌ZUST-1和ZUST-2的atpA基因上发生的突变是同义突变,其编码的氨基酸序列并没有发生改变,而ZUST-2的atpC基因上发生的突变则使氨基酸序列发生了改变,最终使atpC编码的蛋白质结构缺失一个α螺旋。4.通过荧光定量PCR技术,对亲本菌和突变菌H~+-ATPase的全部编码基因的表达水平进行测定,结果发现突变菌ZUST-1和ZUST-2的atpA在对数期基因表达水平分别比亲本菌ZUST下调了41.1%和35.7%,在稳定期分别下调了43.6%和14.2%;ZUST-1的atpC基因在对数期的表达水平比ZUST略高,在稳定期比ZUST上调了30%,而ZUST-2的atpC基因未表达。突变菌H~+-ATPase活性减弱会导致其全部编码基因表达水平在稳定期比对数期上调(除ZUST-2的atpC不表达外),而且atp A和atpC基因突变导致的基因表达水平的差异是影响H~+-ATPase活性的主要因素。5.通过添加双环己基碳二亚胺(DCCD)抑制H~+-ATPase的活力,进一步探究H~+-ATPase的调控机制并验证突变菌H~+-ATPase活性减弱的原因。结果发现,亲本菌ZUST和突变菌ZUST-1、ZUST-2所有编码基因在稳定期表达水平均高于对数期,加入DCCD后菌株自身的应激反应导致各编码基因表达水平升高,同时我们发现不管是否加入DCCD,突变菌ZUST-1的atp A基因表达水平均低于亲本菌,ZUST-2的atpC基因均未表达。这一结果也证实了atpA和atp C在调控H~+-ATPase机制中确实有重要作用,其中atp C基因对H~+-ATPase活力的影响更大,可能是调控H~+-ATPase功能的关键基因。本研究成功筛选得到了H~+-ATPase活力减弱的植物乳杆菌突变菌,并确定了突变菌H~+-ATPase活力减弱的根本原因,发现atpA和atpC基因突变导致的基因表达水平的差异是影响H~+-ATPase活性的主要因素,为得到弱后酸化的植物乳杆菌奠定了理论基础。但是关于每个编码亚基的调控作用及相互间的协同机制还有待进一步深入研究。