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昆虫表皮组织中的表皮蛋白和几丁质是影响表皮机械性能的重要成分,对昆虫生长发育和生命具有重要影响,是特异性生物杀虫剂开发的重要靶之一。本文利用RT-PCR、qRT-PCR、RNAi、Western blotting和组织切片荧光染色等技术,在本研究室已有的工作基础上,进一步深入研究了2个家蚕几丁质合成酶基因(ChsA、ChsB)的生物功能及其与激素和抑制剂调控之间的相互关系;研究了家蚕假定表皮蛋白类似基因(Cph-like)在中肠组织发生和修复过程中的作用。主要结果如下: 1、家蚕ChsA和ChsB基因的表达受外源20E和JHA的调控 本文激素干预试验表明,外源20E和JHA处理对ChsA和ChsB基因表达的影响决定于内源激素的相对水平,而不仅仅是受蜕皮激素(MH)和保幼激素(JH)单一活性的调控。4龄和5龄刚蜕皮后的低MH和高JH内源激素环境中,外源激素具有很强的上调ChsA和ChsB基因表达的作用;龄中期的低内源激素活性环境和入眠幼虫的高MH、低JH内源激素环境中,外源激素的这种上调作用微弱。 2、家蚕表皮特异表达的ChsA基因影响表皮几丁质的含量和幼虫蜕皮 本研究室已经克隆的家蚕ChsA基因(Accession Number:JQ320074),在蜕皮过程中的表皮组织中特异性高表达;早期的ChsA基因的RNAi试验导致不蜕皮蚕和蜕皮异常蚕显著增加。 本文进一步的几丁质合成酶活性抑制剂Nikkomycin Z介入试验表明,在家蚕4龄眠起的幼虫表皮形成过程中,Nikkomycin Z对ChsA基因的转录水平有强力下调作用,表皮中几丁质含量显著降低。幼虫腹部横断面HE切片显示,Nikkomycin Z处理导致幼虫的新表皮变薄、结构的致密性变差;Calcofluour荧光染色切片也显示,Nikkomycin Z处理导致代表几丁质含量的荧光强度减弱。说明Nikkomycin Z可以显著影响ChsA基因的表达水平,抑制表皮组织的几丁质合成。 3、家蚕消化管特异表达的ChsB基因影响消化管的形态 本研究室已经克隆的家蚕ChsB基因(Accession Number:JQ074175),只在消化管组织中特异性高表达。本文在4龄起蚕和将眠蚕的抑制剂介入实验表明, Nikkomycin Z可上调ChsB基因的表达,HE切片及Calcofluour荧光染色切片显示,中肠围食膜中几丁质含量下降;解剖发现中肠已出现白色溃烂。说明Nikkomycin Z在上调消化管ChsB基因表达的同时降低了消化管对围食膜分泌的几丁质的量。 将眠期的ChsB基因RNAi实验结果表明,伴随着ChsB基因表达量的下调,发育异常家蚕的比例显著增加,并出现蜕皮异常。说明家蚕幼虫ChsB基因的表达,直接影响依赖几丁质合成的中肠围食膜再生过程,并进一步影响到家蚕幼虫的蜕皮。 4、家蚕Cph-like基因可能参与了中肠的组织发生与修复过程 Cph-like基因是本研究小组通过消化管性别差异 SAGE文库筛选出的一个消化管特异性高表达基因,其表达受内分泌激素和进食影响。本文进一步的 RNAi处理和CPV病毒感染实验结果显示,家蚕雄性幼虫的CPV抵抗性优势与Cph-like基因的表达有关。蛋白序列分析显示,家蚕 CPH-like蛋白不属于围食膜蛋白;Western blot结果表明,CPH-like蛋白属中肠蛋白。干涉ChsB基因后,家蚕中肠发生溃烂,蜕皮异常;与此同时CPH-like蛋白的表达水平下调。暗示Cph-like基因表达可能参与了中肠的组织发生和修复过程。