背景：肠上皮细胞(IEC)处于机体与外界抗原接触的第一线，时时刻刻都在接触大量的细菌及其内毒素却不被激活，其中必然存在相应的耐受机制。而且近年来研究发现肠粘膜屏障功能下降和由此所致的肠源性细菌、内毒素移位与外科重症病人的全身感染(sepsis)、多器官功能衰竭综合征(MODS)等并发症密切相关。因此深入认识肠粘膜屏障功能、阐明IEC耐受内毒素的机制有可能为内毒素血症的防治提供新的思路。目前国内尚无这方面的研究报导，而且由于没有人正常IEC细胞株，国外的研究资料都来自培养实验动物细胞和人结肠癌细胞。很显然，上述两种细胞都有其局限性，用它们作为研究对象所获得的结果不能完全人体实际情况。因此，本课题拟首先建立稳定的较纯的人肠上细胞原代培养模型，并在此基础上系统观察肠上皮细胞对LPS刺激的反应性，进而探讨其耐受内毒素的分子机制。目的：① 探讨人正常肠上皮细胞(IEC)的分离、培养及鉴定方法。② 观察人肠上皮细胞对内毒素刺激的反应性，探讨其耐受内毒素的分子机制。方法：① 原代培养人正常肠上皮细胞(IEC)：取4～6个月合法引产胎儿小肠，用嗜热菌蛋白酶消化分离IEC，接种于含多种促IEC生长的营养成分的DMEM培养液内，根据IEC和成纤维细胞贴壁时间的差异来纯化IEC，通过观察IEC生长状态、形态特征、超微结构及检测上皮细胞膜抗原对IEC进行鉴定。② 观察肠上皮细胞对内毒素刺激的反应性：收集内毒素量效刺激肠上皮细胞(HIC)18小时后的培养上清液，用ELISA法检测IL-8的水平；提取内毒素量效刺激1小时后的肠上皮细胞(HIC)核蛋白，用EMSA法检测NF-κB的活性变化。③ 检测肠上皮细胞内毒素相关受体mRNA表达：提取有、无内毒素刺激的人正常肠上皮细胞及阳性对照THP1细胞的总RNA，用RT-PCR方法检测TLR4,TLR2,CD14和MD2 mRNA的表达，用RPA法检测TLR4,CD14和MD2 mRNA的表达。用RT-PCR方法检测人小肠癌上皮细胞株(HIC)TLR4,CD14和MD2 mRNA的表达。④ 检测转染内毒素相关受体基因后的HIC对内毒素刺激的反应性改变：用<WP=7>FUGENE 6 转染试剂将TLR4,TLR2,CD14表达质粒转染HIC，用内毒素刺激转染后的HIC，检测其NF-κB的活性和IL-8的水平变化。结果：① 肠上皮细胞原代培养成功：嗜热菌蛋白酶消化2h可分离出大量的健全绒毛隐窝单位，进一步培养获得的IEC,上皮细胞膜抗原均呈阳性。② 肠上皮细胞株(HIC)对内毒素刺激呈低反应性：内毒素量效刺激肠上皮细胞株(HIC)后，均检测不到NF-κB的激活和IL-8的分泌。③ 肠上皮细胞内毒素相关受体mRNA低表达或不表达：人正常肠上皮细胞TLR4,TLR2,CD14和MD2 mRNA呈低表达。内毒素刺激后，TLR4,CD14和MD2 mRNA表达进一步减弱，而TLR2的表达无显著变化。HIC不表达 TLR4,CD14和MD2 mRNA。④ 转染内毒素相关受体基因后的HIC对内毒素刺激具有明显的反应性：转染TLR4,CD14和MD2质粒的肠上皮细胞受LPS刺激后，检测到较强的NF-κB活性和明显的IL-8分泌；仅转染TLR4,CD14质粒的肠上皮细胞受LPS刺激后，检测到较弱的NF-κB活性，未检测到IL-8的分泌；不转染对照组、转染空质粒组均未检测到NF-κB活性和IL-8的分泌。结论：① 选用嗜热菌蛋白酶作为分离IEC的消化酶，改善IEC的生长环境，经过简便的纯化，即可获得较纯的IEC，完全可供相关实验研究之用。② 本研究以检测NF-κB的激活和IL-8的分泌为客观指标，首次观察了小肠上皮细胞对内毒素刺激的反应性，进一步证实，与单核/巨噬细胞不同，肠上皮细胞呈内毒素无反应性。③ 首次用RT-PCR和RPA两种方法同时研究了人原代小肠上皮细胞和人小肠癌上皮细胞内三种内毒素相关受体mRNA的表达特点，发现无论人原代小肠上皮细胞和人小肠癌上皮细胞TLR4,CD14和MD2呈低表达或不表达。④ 采用基因转染技术，首次揭示了肠上皮细胞表面TLR4,CD14和MD2低表达或不表达与细胞内毒素无反应性之间的内在联系，明确了肠上皮细胞耐受内毒素作用的分子机制，同时进一步反证了CD14,TLR4和MD2在调控单核/巨噬细胞内毒素跨膜信号转导中的作用。