单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，LM）是一种人畜共患的病菌，并且是重要的食源性病原微生物之一，分布广泛，易感人群较多，可引起人类和动物的败血症、流产、脑膜炎和胃肠炎等临床症状。其中hly基因是李斯特菌的重要的毒力基因，hly编码形成的蛋白大小约为60ku，称为溶血素（LLO），李斯特菌溶血素能溶解多数哺乳动物的红细胞，是一种孔形成毒素，能协助LM进入靶细胞，及逃逸吞噬小体。本实验在生物信息学分析的基础上，参照hly全基因序列设计五对特异性引物，应用PCR扩增产单核细胞李斯特菌的溶血素基因hly，获得大小分别约为1600bp、980bp、675bp、540bp、620bp的目的片段，并pMD18-T Simple载体连接，经酶切、PCR鉴定、测序鉴定。该基因片段与pET30b表达载体经BamHⅠ、XhoⅠ处理后进行连接，并转化BL21感受态细胞。通过酶切、PCR鉴定及序列测定后，尝试诱导表达，并保存获得的阳性表达重组质粒，表达结果发现分段表达的蛋白全部是以包涵体形式表达，所以尝试将重组质粒与分子伴侣质粒pG-KJE8共同转化到BL21中，并用终浓度为1mg/ml L-阿拉伯糖和0.2mmol/L的IPTG进行分步诱导表达。SDS-PAGE电泳分析结果表明利用分子伴侣的共表达系统，其中重组李斯特菌溶血素蛋白以可溶形式表达。应用可溶形式表达的李斯特菌溶血素蛋白进行溶血实验发现其具有溶血活性，但是将重组LLO蛋白进行纯化后免疫BALB/c小鼠，收集阳性血清进行Western blot及ELISA分析后发现并不与LM分泌的天然LLO发生特异性结合。对LM培养进行培养后，经SDS-PAGE分析，在60ku大小存在目的蛋白，并通过溶血实验验证此蛋白为LLO蛋白，将LM上清液进行过滤除菌后将其用PEG20000进行浓缩，并用甲醛37℃灭活脱毒后，免疫BALB/c小鼠，免疫两周后的第7天，将LM上清液进行稀释后，利用间接ELISA方法确定抗原与血清最佳工作浓度。细胞融合后，应用建立间接ELISA方法将LM上清液稀释16倍进行包被后，对单抗进行筛选。最终经过三次克隆化，成功得到3株杂交瘤细胞，分别命名为5E3、3G7、4B7。这3株杂交瘤细胞能稳定分泌抗溶血素（LLO）的单克隆抗体。亚类鉴定结果5E3、3G7、4B7分泌的单克隆抗体都为IgGl型，Westem blot检测该单克隆抗体具有很好的反应特异性。经连续30代传代，冻存复苏后进行ELISA检测，存前后OD值相差不大，说明这3株杂交瘤细胞能够稳定分泌特异性单克隆抗体。这为进一步研究LLO的致病机理、生物学特性以及建立LM的快速、特异性和灵敏度高的检测方法提供了条件。