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再生障碍性贫血(aplastic anemia,AA)简称再障，是由多种因素引起的骨髓造血功能衰竭，并以全血细胞减少为主要临床表现的一种综合症。由于免疫抑制疗法在再障治疗中的成功应用，关于再障产生的免疫因素成为血液学和免疫学工作者共同关注的问题。经过近三十年的系统研究，T细胞在再障形成中的主导作用逐步得到确证。目前，再障被认为是一种与免疫密切相关的、主要由T细胞介导的、具有器官特异性自身免疫病特征的血液系统疾病。T细胞的异常活化是再障产生的免疫病理机制中的核心事件。本课题即以此为核心，就再障患者体内异常活化T细胞的长期生存机制及其潜在的凋亡介导功能进行了研究。激活诱导的细胞死亡(activation-induced cell death,AICD)，是近年来发现的一种重要的维持体内T细胞稳态及T细胞外周耐受的机制。AICD机制的障碍也于近年来被认为是以自身耐受的破坏为特征的自身免疫病(尤其是与T细胞相关的器官特异性自身免疫病)的一个重要诱发因素。有着促T细胞增殖和抗AICD双重功效的T细胞生长因子——IL-15也因此而成为自身免疫病研究的关注对象，并被证实与许多自身免疫病密切相关。鉴此，本课题围绕T细胞异常活化所做的第一部分工作就是对骨髓造血微环境的主要构成细胞——骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)在再障情况下是否存在IL-15的异常表达进行研究。通过对再障患者的BMSCs(AA-BMSCs)进行体外原代培养，借助免疫荧光标记和流式细胞技术，在AA-BMSCs上检测到IL-15特异的荧光信号，平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)比值(MFI_sample／MFI_isotype)为5.62±2.14，而正常对照组几乎检测不到IL-15特征性的荧光信号，MFI比值为1.01±0.30，两者相比有显著性差异(P＜0.001)。此外，借助激光共聚焦显微分析技术，在AA-BMSCs上观察到有膜特征性的、IL-15特异的荧光信号。上再生障碍性贫血活化T细胞长期生存机制及其潜在凋亡介导功能的研究中文摘要述结果表明，AA一BMSCs上有膜结合型IL一15(membrane一bound IL一15，mIL一15)的异常表达。在终止培养前24h向AA~B MSCs培养体系中加入50OU/1 nl的正N-Y，可以诱导AA一BMSCs上mIL一15的上调表达，MFI比值上升至22.17士4.31，与不加IFN一Y组相比差异显著(尸<0.001);而1 p g/ml的CsA的同时加入，可以显著地抑制IFN一丫对AA一BMSCs上mIL一巧表达的上调效应，MFI比值降至10.87士3.37，与不加CsA组相比差异显著(p<0.001)。此外，用3H掺入法进行的细胞增殖实验显示，AA一BMSCs具有显著的促T细胞增殖活性。抗IL一15Ab和抗IL一2/15R丫cmAb可显著抑制AA一BMSCs的促T细胞增殖活性，且两种抗体在功能上表现出一定的协同效应。另外，将AA一BMSCs与T细胞用隔膜孔径为0.3协m的介皿swell小室加以隔断，可以完全阻断AA一BMSCs对T细胞的促增殖效应。上述结果表明，AA一BMSCs的促T细胞增殖活性主要由其表面的mIL一巧介导。AA一BMSCs表面功能性nilL一巧异常表达现象的发现，不仅从基础的角度，对再障患者体内(尤其是骨髓造血微环境中)异常活化T细胞长期存在的现象作出了合理的解释，而且也为临床工作给予了有益的提示，如是否能够以IL一15这一导致T细胞AICD机制障碍的分子为靶向，设计一些更为合理的AA免疫抑制治疗方案，使异常活化的T细胞及时地步入凋亡，而保留静息T细胞必要的免疫应答和免疫监视功能，从而避免或减少由于广谱性免疫抑制剂的过量使用所导致的再障治疗后期由于患者免疫功能的低下而出现的远期克隆性疾病(如阵发性睡眠性血红蛋白尿、骨髓异常增生综合症及白血病等)。 本课题围绕T细胞异常活化所做的第二部分工作，是关于再障患者体内异常活化T细胞与Fas压asL相关的凋亡介导功能。如前所述，T细胞的异常活化是再障产生的免疫病理机制中的核心事件。根据再障患者体内的造血干/祖细胞表面Fas的表达明显升高这一现象，人们设想再障患者体内的异常活化T细胞可能会以表达大量膜结合型FasL的方式介入再障的造血抑制过程。近来在T细胞系上进行的一系列研究表明，作为FasL的主要表达细胞，T细胞上FasL的表达受到严格的制约，大多数情况下并不组成型表达在活化T细胞表面，而是以预存蛋白的形式蓄积在活化T细胞的胞浆当中.而且，为了使预存的FasL能够以更为有效的形式释放，胞浆中的Fas被预先组装在有一定膜结构的微囊上，再生障碍性贫血活化T细胞长期生存机制及其潜在凋亡介导功能的研究中文摘要受激发时以细胞外体(Exosomes)的形式向外释放。鉴此，我们就再障T细胞上是否也存在着上述在T细胞系中观察到的FasL表达的调节机制进行了研究。流式细胞的分析结果显示，再障T细胞的胞浆中含有高浓度的FasL，MFI值为28.1士6.1:而胞膜上FasL的含量极低，MFI值仅为4.3士0.5。通过与正常“静息”T细胞和T淋巴母细胞比较，发现再障T细胞有近似T淋巴母细胞的表现。用50pg/ml PHA一过性刺激后，再行流式细胞分析发现，再障T细胞胞浆FasL的含量大幅下降，M