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目的:首先,基于二代测序RNA-sequencing(RNA-seq)技术和高通量大数据分析方法鉴定和分析人类来源HSC细胞(human Hepatic Stellate Cell,hHSC)活化和静止过程中差异的长链非编码RNA(Long noncoding RNA,lncRNA)和mRNA表达谱改变。分析差异表达(Differentially Expressed,DE)的lncRNA可能的分子功能和参与调控的通路。鉴定出通过抑制hHSC活化的重要抗肝纤维化lncRNAs分子,为抗肝纤维化机制研究和药物治疗靶点研究提供潜在的lncRNA分子机制。最后,探讨中药单体青蒿琥酯对hHSC活化的影响,阐明青蒿琥酯参与hHSC活化或静息内在机制。从而发掘青蒿琥酯抗肝纤维的潜在药物机制,为其临床提供科学依据。方法:本研究采用丙戊酸(Valproic acid,VPA)诱导活化的hHSC静息,建立抗肝纤维化的细胞模型;提取活化和静止的hHSC样品中的Total RNA建RNA文库,应用RNA-seq技术对活化和静息的hHSC样品进行测序;利用HISAT对比软件和StringTie对测序得到的reads进行比对和组装得到每个样本中所有转录本序列。采用三款预测软件CPC,txCdsPredict以及CNCI和一个蛋白数据库pfam同时对转录本的编码能力进行打分预测,以鉴定转录本中的lncRNA。利用GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes&Genomes)生物功能富集分析显著性差异表达的lncRNA的在hHSC活化过程中的分子功能和参与的信号通路;用qPCR随机检查RNA-seq中差异表达lncRNAs。采用qPCR检测hHSC中肝纤维化生物标记物α平滑肌肌动蛋白基因(actin,alpha2smooth muscle,ACTA2)和Ⅰ胶原蛋白基因(Collagen TypeⅠalpha 1 chain,COL1A1)的表达水平,以鉴定抑制hHSC活化的中药单体;利用蛋白免疫印迹(Western Blotting)方法检测6味中药单体对上皮细胞-间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)的影响,以确定青蒿琥酯抑制EMT的作用;结合细胞免疫荧光技术和qPCR技术检测青蒿琥酯影响hHSC活化的浓度和时间;蛋白免疫印迹(Western Blotting)和qPCR技术鉴定青蒿琥酯在hHSC中对EMT的影响及有意义的浓度。结果：(一)丙戊酸(Valproic acid,VPA)逆转活化hHSCs为静止表型的鉴定结果。与正常组(con组)相比,VPA(1.25,2.5和5.0 mM)6 h组的α-SMA细胞荧光强度慢慢降低,α-SMA表达水平下调;而VPA 5.0mM 4 d组的α-SMA表达比任何VPA组(1.25,2.5和5.0 mM)6h组和con组下调效果更明显。此外,qPCR检测肝纤维化相关的标记物基因,结果表明,与正常组相比,VPA 5.0mM干预hHSC 4天后,肝纤维化的标记基因ACTA2、COL1A1、LOX、LOXL2均呈显著下调表达。(二)表达于活化和静息hHSC中lncRNAs生物信息分析结果。本研究中,最终平均每个样本中一共鉴定到了28091 lncRNAs转录本,转录物数目的外显子分布分析表明,表达于hHSC的lncRNA和mRNA主要集中在1-3和10+的外显子数目中,而mRNA外显子的平均数大于lncRNA外显子均数。此外,本研究共鉴定到了3763个显著差异的lncRNAs表达于活化和静息的hHSC中。通过GO和KEGG分析,我们发现显著差异的lncRNAs主要通过参与"nucleosome"、"DNAbending complex"、"DNA packaging complex"、"actin cap"和"growth factor binding"五个GO的分子功能项和"Hippo"信号通路等途径调节hHSC活化(P<0.05)。用lncRNA-mRNA共表达分析发现有38个差异lncRNA与30 mRNA有互作关系,每个lncRNA与一个或多个mRNA有共表达互作关系;其中发现有与CTGF和FGF2存在共表达关系的lncRNAs。随机挑选的8个差异表达的lncRNA和3对lncRNA-mRNA表达对的表达趋势与测序数据一致。(三)青蒿琥酯抑制hHSC活化的机制研究结果。在11味中药单体诱导hHSC细胞48h条件下,qPCR检测结果发现,与正常组相比,青蒿琥酯组中ACTA2和COL1A1均下调表达,并且具有统计学意义(**P<0.01);不同浓度的青蒿琥酯(10-50μM)干预hHSC细胞48h后,细胞免疫荧光检测α-SMA结果表明:青蒿琥酯干预hHSC48小时后,在浓度为30μM时,α-SMA的表达水平开始下降明显,在40-50μM时,α-SMA稳定下调表达。Western Blot检测6种中药单体对hHSC上皮细胞间充质转化结果表明,与正常组相比,青蒿琥酯组的锌指转录因子(Slug)和N-钙粘蛋白(N-cadherin,N-cad)均下调表达。不同浓度的青蒿琥酯(10μM,20μM,30μM,40μM和50μM)干预hHSC细胞48h后,蛋白免疫印迹结果表明与正常组相比,在青蒿琥酯处理组中,Slug和N-cad的表达下调,结果:而E-钙粘蛋白(E-cadherin,E-cad)的表达升高,以浓度为30μM、40μM和50μM组最为明显。结论:本研究建立了一种简单方便的诱导hHSC静止的细胞模型方法;应用RNA-seq技术和生物信息分析方法在hHSC细胞水平建立抗肝纤维化lncRNA表达谱,为筛选关键抗肝纤维化先关lncRNAs提供依据;另外,在活化的hHSC逆转为静息表型的过程中,差异表达的lncRNAs参与的潜在分子功能和信号通路主要包括"nucleosome"、"DNAbending complex"、"DNA packaging complex"、"actin cap"和"growth factor binding"五个分子功能和"Hippo"信号通路;共表达网络分析预测了关键lncRNA的靶基因并筛选出与抗肝纤维化相关的关键lncRNA靶向的mRNA。本研究最后部分结果表明青蒿琥酯通过阻滞上皮细胞-间充质转化(Epithelial Cell-Mesenchymal Transition,EMT)过程而抑制hHSC的活化。