论文部分内容阅读
根据已知 CYP4家族的保守氨基酸区域设计引物,应用cDNA末端快速扩增(RACE)技术,首次从我国近海广泛分布的多毛类——不倒翁虫(Sternaspis scutata)体内克隆出细胞色素氧化酶CYP4基因cDNA序列。经生物信息学分析显示,该序列全长为1829bp,5’端非翻译区27 bp,3’端非翻译区272 bp,开放阅读框为1530 bp,编码509个氨基酸。该蛋白理论等电点为4.96,相对分子质量为149744Da。为无信号肽的具有一个跨膜区的亲水性蛋白。疏水性最大为3.61,最小值为-3.99,均值为-0.265,整个多肽链中大多数氨基酸的分值较低,亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸。推导的氨基酸序列中,第309~321氨基酸序列具有疏水螺旋I区EVDTFMFEGHDTT;第374~377氨基酸序列存在K螺旋特征基序 ExxR区;第447~456氨基酸序列符合 P450所具有的结构保守共有序列血红素结合区FxxGxxxCxG。经Blast与GenBank中已知物种的氨基酸序列进行相似性比对,与多毛类双齿围沙蚕 Nereis aibuhitensis CYP4V亚家族基因(JQ867402)氨基酸相似性为58%,与多毛类绿沙蚕Alitta virens CYP4BB1、CYP342A1氨基酸相似性为29%、31%,与多毛类小头虫 Capitella capitata CYP4AT1相似性为35%。因此推断不倒翁虫 CYP4基因属于CYP4V亚家族,提交GenBank获基因登录号为KM104864。 根据不倒翁虫(Sternaspis scutata) CYP4 cDNA序列全长和actin mRNA序列设计合成引物,建立了不倒翁虫 CYP4的荧光实时定量 PCR检测方法,用于检测栖息于沉积环境中不倒翁虫 CYP4在我国黄渤海近岸不同海域的表达特征和规律,并通过气象色谱-质谱联用仪对不倒翁虫栖息的沉积物中16种PAHs组分进行定量分析。根据实时定量PCR结果分析,各个海域不倒翁虫 CYP基因表达均存在差异性,其中,大连湾和红沿河海域、长兴岛和秦皇岛海域的不倒翁虫CYP4基因的表达量间是存在显著差异,其余的海域不倒翁虫CYP4基因表达量间都存在极显著差异。沉积物中多环芳烃含量由高到低依次为大连湾、红沿河、长兴岛、金州湾、庄河、秦皇岛海域。结合各海域沉积物中多环芳烃含量,分析了CYP基因表达量的变化与海域沉积物多环芳烃含量间的相关性。相关关系表明,黄渤海近岸海域中不倒翁虫的CYP4相对表达量与沉积物中多环芳烃总量呈正相关(p=0.037),即沉积物中多环芳烃的含量高,该沉积物中生长的不倒翁虫 CYP4基因表达量就相应高。因此,不倒翁虫体内的CYP4基因对高浓度的多环芳烃有响应,CYP4对多环芳烃有一定的解毒作用。