【摘 要】
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小菜蛾Plutella xylostella（L.）是十字花科作物的重要害虫,具有分布广、世代短、繁殖快、抗药性发展迅速等特点,给蔬菜生产造成了巨额的经济损失。由于化学杀虫剂的不合理使用,导致小菜蛾对目前市面上所有类型的杀虫剂都产生了不同程度的抗药性,所以探究小菜蛾对杀虫剂的抗药性机理迫在眉睫。解毒酶介导的代谢抗性在小菜蛾对杀虫剂的抗药性机理中尤为重要,但小菜蛾解毒酶对很多杀虫剂解毒代谢的分子机制
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（31872012）； 陕西省重点研发计划项目（2019NY-186）； 杨凌示范区科技计划项目（2018NY-02）；
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小菜蛾Plutella xylostella（L.）是十字花科作物的重要害虫,具有分布广、世代短、繁殖快、抗药性发展迅速等特点,给蔬菜生产造成了巨额的经济损失。由于化学杀虫剂的不合理使用,导致小菜蛾对目前市面上所有类型的杀虫剂都产生了不同程度的抗药性,所以探究小菜蛾对杀虫剂的抗药性机理迫在眉睫。解毒酶介导的代谢抗性在小菜蛾对杀虫剂的抗药性机理中尤为重要,但小菜蛾解毒酶对很多杀虫剂解毒代谢的分子机制尚不明确。因此,研究小菜蛾解毒酶的作用机理对解决小菜蛾的抗药性问题具有重要科学价值和应用前景。本研究通过解毒酶活性分析的方法,研究了小菜蛾解毒酶对斑蝥素的解毒代谢功能;采用分子生物学实验和计算机分子模拟结合的手段研究了小菜蛾谷胱甘肽-S-转移酶（PxGSTs）对唑虫酰胺（TFP）解毒代谢的分子机理;联合使用同源模建、分子动力学（MD）模拟、单残基能量分解、计算丙氨酸扫描（CAS）等方法,以谷胱甘肽-S-转移酶（GST）抑制剂——S-己基谷胱甘肽（GTX）为分子探针分析了PxGSTs与化合物的相互作用方式以及结合的关键氨基酸;通过蛋白质三维结构模建、分子对接、分子动力学模拟等技术联合分子生物学实验,阐明了小菜蛾羧酸酯酶（PxEst-6）代谢4种拟除虫菊酯（联苯菊酯,氟氯氰菊酯,氯氰菊酯和λ-氯氟氰菊酯）的分子机理。主要研究结果如下:1.小菜蛾解毒酶系对斑蝥素的解毒代谢目前关于小菜蛾对生物源杀虫剂的解毒代谢已有大量的报道,但是相关研究还未涉及小菜蛾对斑蝥素的解毒代谢。我们通过对小菜蛾解毒酶系（谷胱甘肽-S-转移酶,羧酸酯酶和细胞色素P450酶）和PSPs酶系活性的测定,发现亚致死剂量的斑蝥素处理后小菜蛾体内PSPs的活性呈现出随时间先降低后逐步恢复的趋势;而小菜蛾体内解毒酶系的活性呈现出先降低后升高的趋势（P450酶活性的升高最为显著）,且解毒酶系活性升高的趋势与PSPs酶系活性恢复的趋势相同。该结果表明小菜蛾解毒酶能够在体内对斑蝥素解毒代谢,并使PSPs被抑制的活性逐渐恢复,该研究结果填补了小菜蛾解毒酶系对斑蝥素的解毒代谢功能的空白。2.小菜蛾PxGSTs对唑虫酰胺的解毒代谢作用关于昆虫GSTs在唑虫酰胺解毒代谢中的作用目前还知之甚少。我们以小菜蛾为研究对象通过RT-q PCR分析发现,小菜蛾在经唑虫酰胺处理后PxGSTs（PxGSTδ、PxGSTσ和PxGSTε）的表达量明显上调。体外抑制实验和代谢实验发现,唑虫酰胺对PxGSTs具有一定的抑制效果,并且PxGSTs能够在体外代谢唑虫酰胺,其中PxGSTσ具有最高的代谢效率。基于分子对接的结合模式分析结果表明,Tyr107和Tyr162侧链提供的氢键是PxGSTσ代谢唑虫酰胺的关键相互作用。对Tyr107（PxGSTσY107A）和Tyr162（PxGSTσY162A）位点进行丙氨酸定点突变后发现,突变体蛋白对唑虫酰胺的结合和代谢能力大幅度下降,揭示了PxGSTs和唑虫酰胺之间的代谢相互作用,并阐明了PxGSTσ对唑虫酰胺代谢的分子机理,为新型唑虫酰胺类杀虫剂的设计和优化提供了新的方法。3.小菜蛾PxGSTs与其抑制剂GTX的相互作用昆虫GSTs参与了多种杀虫剂的代谢抗性,以GST抑制剂GTX为分子探针可以揭示杀虫剂抑制昆虫GSTs的分子机理。我们采用同源性模建和分子对接的方法构建了PxGSTσ与GTX分子的三维结构模型（PxGSTσ-GTX）,并通过分子动力学（MD）模拟和结合自由能计算描述了PxGSTσ-GTX复合物的稳定性。通过结合自由能的分析发现,PxGSTσ-GTX复合物的形成和稳定主要由氨基酸残基侧链提供的氢键和疏水相互作用来驱动。通过丙氨酸扫描和定点诱变发现,Lys43和Arg99是PxGSTσ与GTX结合的关键氨基酸位点。并且结合唑虫酰胺与PxGSTσ相互作用的关键位点分析,发现Tyr107可能是化合物对PxGSTσ产生抑制作用的关键残基。该结果为研究现有杀虫剂抑制GST解毒酶系的分子机理提供了结构生物学的参照,为评估新型杀虫剂与GST解毒酶系的相互作用提供了理论指导。4.小菜蛾羧酸酯酶PxEst-6对拟除虫菊酯的代谢机理羧酸酯酶（Car Es）是昆虫体内一种涉及拟除虫菊酯抗药性的解毒酶。我们通过RT-q PCR分析发现,PxEst-6在小菜蛾三龄幼虫的中肠和表皮内高表达,在经4种拟除虫菊酯类杀虫剂（联苯菊酯,氟氯氰菊酯,氯氰菊酯和λ-氯氟氰菊酯）处理后,PxEst-6的表达量迅速上调。通过杀虫剂代谢实验发现PxEst-6具有代谢这4种拟除虫菊酯杀虫剂的能力。通过三维结构模建、分子对接和分子动力学模拟分析了PxEst-6与拟除虫菊酯的结合模式,揭示了参与代谢的关键氨基酸残基和相互作用方式,结果表明PxEst-6通过Gln431、His451和Lys458残基与拟除虫菊酯的乙酸酯基团发生极性或氢键相互作用从而对其进行代谢,并以丙氨酸定点突变对这一结果进行了验证,阐明了PxEst-6代谢拟除虫菊酯类杀虫剂的分子机理。
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