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脆性X综合佂（Fragile X syndrome ,FXS)是一个单基因遗传性疾病,它是由X连锁的FMR1基因5’端(CGG)n三核苷酸重复序列异常扩增及其相邻部位的CpG岛异常甲基化,使其编码产物FMRP(fragile X mental retardation protein)不能正常表达所致。临床症状表现为不同程度的智力低下,注意力缺陷,活动过度,焦虑伴情绪波动,强迫症,孤独症,以及运动协调不良和癫痫,大耳、关节过度伸展和青春后巨睾症等。对脆性X综合征动物模型的研究中发现mGluRⅠ的过度激活可能是产生脆性X综合征各种临床症状的主要因素。FMR-1基因敲除小鼠表现出巨睾、认知功能障碍、听源性惊厥发作和异常行为,但听源性惊厥发作的原因及机制尚不明确,对FMR-1基因敲除小鼠海马神经元突触可塑性的研究表明脆性X综合征的表型和mGluRⅠ存在联系。在FMR-1基因敲除小鼠海马脑片应用mGluRⅠ的激动剂DHPG可以增加CA1区的长时程增强(LTP)。Richter等报道,学习训练后的大鼠LTP的形成与脑内细胞外GLU浓度的升高有关,并且依赖于NMDA受体的激活。大量证据表明,Glu递质释放后,通过激活NMDA受体,诱导LTP的形成,从而对学习、记忆行为进行调节。有研究发现FMR-1基因敲除小鼠的听源性惊厥发作与兴奋性氨基酸及抑制性氨基酸的比例失调相关,但KO小鼠听阈的变化目前国内外尚未见报导。有关报导FXS野生型小鼠的海马、间脑、脑干等区域中抑制性神经递质GABA明显降低,其合成酶谷氨酸脱羧酶(GAD)增高。【研究目的】本研究对不同周龄的FMR-1基因敲除小鼠(KO)与野生型小鼠(WT)的听源性惊厥的观察,对不同周龄的KO与WT小鼠听阈进行检测并对比,了解KO小鼠的听阈变化;利用免疫组织化学方法,通过观察KO与WT小鼠大脑皮层和脑干蜗神经核和上橄榄核复合体中GAD的表达,探讨GAD的表达是否受FMRP的影响,为FMR-1基因敲除小鼠听源性惊厥的发病机理提供一定的依据。【材料和方法】1.实验动物:FMR1基因敲除型(KO)纯合子(-/-)及其野生型(WT)纯合子(+/+)FVB近交系小鼠。2.实验动物基因型鉴定:采用PCR法检测实验小鼠的Fmr-1基因片段。3.动物分组:3.1实验动物,150只。分两组(1)KO组(2周龄,3周龄,4周龄,6周龄, 8周龄,每周龄15只)75只;(2)WT组(2周龄,3周龄,4周龄,6周龄, 8周龄,每周龄15只)75只。用于观察听源性惊厥行为。3.2实验动物,150只。分两组(1)KO组(3周龄,4周龄,6周龄, 8周龄,10周龄,每周龄15只)75只;(2)WT组(3周龄,4周龄,6周龄, 8周龄,10周龄,每周龄15只)75只。用于听性脑干反应(ABR)测试和免疫组织化学染色。4.数据及图像的采集:以ABR图形中II波的阈值为小鼠的ABR阈值,免疫组化的结果用Image J 13.7软件对免疫组织化学GAD表达的阳性细胞平均光密度值(OD)进行分析。5.统计方法:各组数据均用均数±标准差(X±SD)表示,多组数据的比较用单因素的方差分析(one-way AVONA)。用SPSS16.0软件进行统计学分析,P值﹤0.05为有统计学意义。【实验结果】1.经基因鉴定后KO组小鼠均为FMR-1基因敲除型小鼠;2. FMR-1基因敲除小鼠的惊厥阈值均较野生型小鼠显著低,P<0.05差异有显著性。FMR-1基因敲除小鼠受声音刺激后先出现AGS前驱表现-惊恐、奔跑,、惊厥,呈角弓反张,最后恢复活动能力或者反复发作,或者死亡;3. ABR阈值:3周及4周年龄组小鼠各基因型间KO小鼠的ABR阈值显著高于WT小鼠,P<0.01,差异有显著性;6周、8周、10周各组中各基因型小鼠的KO小鼠和WT小鼠的ABR阈值的,P>0.05,差异无统计学意义。4.免疫组织化学染色:3周、4周、6周、8周和10周年龄组小鼠各基因型间KO小鼠的听觉皮层、蜗神经核和上橄榄核复合体中GAD表达的平均光密度值(OD)均高于WT小鼠,P<0.01,差异有显著性。【结论】1. FMR-1基因敲除小鼠存在AGS,而且有年龄依赖性;2.幼年期FMR-1 KO小鼠听阈提高,成熟期FMR-1 KO小鼠听阈无异常,KO小鼠AGS发生的年龄依赖性与ABR的结果相一致;3. FMR-1 KO小鼠的听觉皮层、蜗神经核和上橄榄核复合体中GAD的表达较WT小鼠的均显著增高,提示GABA系统在听觉传导通路中的变化参与AGS的发生。