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研究背景:哮喘是严重危害人类健康的免疫疾病。流行病学调查证实孕期接触烟草烟雾与子代哮喘发病率增加密切相关,而烟雾的主要活性成分尼古丁在其中所起的作用及相关机制有待进一步研究。肺2型辅助T细胞（T helper cell 2,Th2）/Th1偏移及Th17/调节性T细胞（T regulatory cells,Tregs）偏移是哮喘易感的重要免疫机制。本室前期发现,孕期尼古丁暴露（Prenatal nicotine exposure,PNE）可致子代脾脏IL-4（Th2细胞因子）表达增加,哺乳期尼古丁暴露可引起子代脾脏Th17/Tregs偏移。因此我们推测,PNE可能导致子代肺Th2及Th17偏移进而引起哮喘易感。胸腺细胞中GATA3（Th2发育关键基因）、T-bet（Th1）、RORγt（Th17）及Foxp3（Tregs）表达异常会引起外周T细胞偏移。本室已证实PNE可抑制胎胸腺细胞发育,而PNE能否改变胸腺细胞GATA3等基因的表达进而导致子代Th2及Th17偏移有待探究。β-catenin是胸腺细胞发育过程的主要调控信号,其作为转录因子可促进GATA3及RORγt表达,引起Th2及Th17偏移。此外,神经细胞中尼古丁受体n ACh R上调会激活PI3K-AKT,磷酸化GSK3β,进而增加胞内β-catenin水平。提示PNE可能通过升高β-catenin从而上调胸腺细胞中GATA3及RORγt水平。综上所述,我们提出如下假说:PNE环境下,尼古丁作用于胎胸腺细胞,上调α7nAChR,激活PI3K-AKT,增加胞内β-catenin水平,引起GATA3/T-bet以及RORγt/Foxp3升高。这一异常持续到出生后,导致子代肺Th2及Th17偏移,引起哮喘易感性增加。目的:在整体水平,观察到PNE导致子代肺Th2及Th17偏移进而引起哮喘易感。在此基础上,证实PNE通过上调β-catenin信号,导致子代胸腺细胞GATA3/T-bet及RORγt/Foxp3比值编程性升高。最后在细胞水平,阐明尼古丁上调胸腺细胞β-catenin信号的分子机制。方法:（1）Balb/C小鼠受孕第9至18天皮下注射3.0 mg/kg·d尼古丁建立PNE模型。于雌性仔鼠出生后第7天（Postnatal day 7,PD 7）、PD 21及PD 42三个肺T细胞发育的关键时间点,流式细胞术检测肺中Th1、Th2、Th17及Tregs水平。仔鼠6周龄时给予卵清蛋白（Ovalbumin,OVA）建立哮喘模型。肺功能仪检测气道阻力及动态肺顺应性;HE及PAS染色检测肺炎性及气道改变情况;获取肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid,BALF）,计数炎性细胞浸润表型并检测Th1、Th2、Th17及Tregs各自细胞因子水平;检测血清Ig E衡量系统性过敏水平。（2）建立PNE模型,获取胎鼠胸腺细胞。流式细胞术分析发育情况;q PCR检测α7nAChR及T细胞发育关键基因（T-bet、GATA3、RORγt及Foxp3）表达情况;Western blot检测β-catenin及其上游分子（α7nAChR、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、GSK3β及p-GSK3β）水平;免疫荧光分析β-catenin胞内及核内水平。为观察PNE是否编程性引起β-catenin上调及基因表达异常,取PD 21及PD 42仔鼠胸腺组织,检测α7nAChR基因和蛋白表达、β-catenin蛋白水平以及T-bet、GATA3、RORγt和Foxp3的基因表达。（3）分离原代胸腺细胞,进行体外培养。首先,用梯度浓度（0.1μM、1μM和10μM）和梯度时间（24 h、48 h和72 h）的尼古丁处理细胞,检测细胞表型、基因（GATA3、T-bet、RORγt和Foxp3）表达、α7nAChR及β-catenin蛋白水平;此后,经PI3K-AKT的抑制剂（LY294002）预处理再给予尼古丁,检测细胞表型、基因（T-bet、GATA3、RORγt和Foxp3）表达、蛋白（AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β和β-catenin）水平;最后,经α7nAChR阻断剂（α-Bungarotoxin,α-btx）预处理后给予尼古丁,检测细胞表型、基因（T-bet、GATA3、RORγt和Foxp3）表达、蛋白（α7nAChR、PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT）水平。结果:（1）PNE雌性子代小鼠哮喘易感:OVA造模后,与对照组相比,PNE仔鼠气道功能降低（气道阻力增加及动态肺顺应性减少）明显;肺泡结构损坏、气道增厚、粘液分泌及炎性细胞浸润等病理改变明显,HE及PAS病理评分显著增加;BALF中炎性细胞（尤其嗜酸及中性粒细胞）浸润显著增多,IL-4及IL-6（Th2细胞因子）增加、IL-17A（Th17）增加、IFN-γ及TNF-α（Th1）水平偏低,呈现Th2及Th17型免疫反应的过度极化;血清Ig E显著增加。（2）PNE雌性子代小鼠哮喘造模前Th2及Th17偏移:出生后PD 7、PD 21及PD 42三个时间点,与对照组相比,PNE仔鼠均呈现Th2/Th1比值及Th17/Tregs比值增加,即Th2及Th17偏移表型。（3）PNE胎鼠胸腺细胞发育抑制:与对照组相比,PNE胎胸腺重量及脏器指数显著降低;胸腺皮质髓质分界不清晰且细胞稀疏;流式结果呈现CD4+SP减少为特征的发育抑制表型。（4）PNE编程性改变胸腺细胞中T细胞发育基因表达:与对照组相比,PNE胎鼠胸腺细胞中GATA3/T-bet及RORγt/Foxp3比值升高;这一表达模式持续至仔鼠哮喘造模前（PD 42）。（5）PNE编程性上调胸腺细胞β-catenin信号:与对照组相比,PNE胎鼠胸腺细胞α7nAChR基因及蛋白水平显著上调,PI3K-AKT通路激活增加,GSK3β磷酸化灭活增多,β-catenin水平显著增加;PNE所致α7nAChR及β-catenin上调持续到仔鼠哮喘造模前（PD 42）。（6）体外尼古丁处理致胸腺细胞发育异常:与对照组相比,尼古丁处理组胸腺细胞呈现CD4+SP减少为特征的流式表型,GATA3/T-bet及RORγt/Foxp3比值显著增加,α7nAChR和β-catenin蛋白水平显著上调,且这些效应与尼古丁的剂量（0到1μM）和处理时间（0到48 h）线性相关。（7）PI3K-AKT通路介导尼古丁的毒性作用:LY294002预处理明显拮抗尼古丁引起的p-AKT增多、GSK3β灭活增加和β-catenin增多,进一步阻断CD4+SP减少及GATA3等基因表达异常。（8）α7nAChR介导尼古丁所致PI3K-AKT活化:经α-btx预处理,明显抑制尼古丁所致PI3K-AKT信号活化,进一步逆转CD4+SP减少及GATA3等基因表达异常。结论:在PNE作用下,过胎盘的尼古丁对胎胸腺细胞发挥直接毒性作用,通过α7nAChR激活胞内PI3K-AKT信号,活化的p-AKT磷酸化灭活GSK3β,进而引起下游β-catenin增多。β-catenin入核作为转录辅因子促进GATA3和RORγt表达并减少T-bet及Foxp3的转录,引起胸腺细胞GATA3/T-bet及RORγt/Foxp3比值增加。这一基因表达模式可持续至出生后,引起仔鼠外周（肺）逐渐发育为Th2及Th17偏移的免疫失衡表型。接触过敏原刺激,肺中Th2及Th17型免疫反应过度极化,募集炎性细胞,介导哮喘发生。