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镉是环境中常见的高毒性重金属污染物,急性或慢性镉暴露能引起多种器官和组织的损伤。近年来,由于工业生产中镉生产量和使用量的激增及相关工业废物带来的污染加重,使得环境中镉含量呈快速上升趋势;镉在环境中的半衰期长达10-30年,进入环境后不能像有机污染物一样被微生物降解,并且可以通过食物链效应最终蓄积在人体中。因此,镉暴露给公众健康带来的危害引起了广泛关注。肾脏是镉毒性作用的靶器官,国内外学者从环境污染、职业性暴露和动物试验等多等方面对镉所致肾毒性机理进行了广泛、深入地研究;但这些研究多集中于凋亡机理的探究,而对镉所致肾脏毒性过程中自噬的机理、作用及其与凋亡关系的探究较少。1.镉诱导大鼠肾脏皮质和肾小管上皮细胞发生自噬分为体外和体内两部分。体外试验采用机械筛网结合酶消化法建立原代大鼠肾小管上皮细胞(rPT cells)培养模型,在传一代细胞增殖活性最强时间进行镉染毒处理,同时选择NRK-52E细胞株进行同样处理。CCK-8法测定不同浓度的镉在不同染毒时间对rPT细胞和NRK-52E细胞活性的影响;MDC荧光探针法检测不同浓度的镉在不同染毒时间对rPT细胞和NRK-52E细胞自噬水平的影响;2.5 μ和5 μM镉处理rPT细胞、5 ⒚M和10 μM镉处理NRK-52E细胞6 h,免疫印迹法检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ、p62和Beclin-1表达水平变化。结果表明,2.5 μM和5 μM镉处理rPT细胞、5 μM和10μ 镉处理NRK-52E细胞6h,细胞活性最强,自噬水平最高,极显著高于对照组(P<0.01);2.5μM和5μM镉处理rPT细胞、5μM和10μM镉处理NRK-52E细胞12h,细胞自噬水平最低,极显著低于对照组(P<0.01)。体内试验选择SD大鼠32只,随机分为4组:对照组(DDW)和镉组(CdAc2,50mg/kg·bw),饲养1周;对照组(DDW)和镉组(CdAc2,50mg/kg·bw),饲养8周。取肾脏皮质,RT-PCR法检测自噬相关基因LC3、p62和Beclin-1表达量变化;免疫印迹法检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ、p62和Beclin-1表达水平变化。结果表明,镉染毒处理1周后,大鼠肾脏皮质自噬水平极显著高于对照组(P<0.01);与对照组相比Beclin-1表达水平极显著升高(P<0.01)。镉染毒处理8周,大鼠肾脏皮质自噬水平极显著低于对照组(P<0.01)。体外和体内研究表明,低剂量镉短时间处理可以诱导肾脏皮质和肾小管上皮细胞发生自噬,而长时间处理则抑制自噬。2.镉诱导大鼠肾脏皮质和肾小管上皮细胞发生凋亡分为体外和体内两部分。体外试验采用机械筛网结合酶消化法建立原代大鼠肾小管上皮细胞(rPT cells)培养模型,在传一代细胞增殖活性最强时间进行镉染毒处理,同时选择NRK-52E细胞株进行同样处理。DAPI染色法检测不同浓度的镉在不同染毒时间对rPT细胞和NRK-52E细胞凋亡的影响;流式细胞术检测2.5 μM和5μ 镉处理rPT细胞、5(μM和10 μM镉处理NRK-52E细胞12 h,细胞凋亡率变化;免疫印迹法检测2.5 μM和5 μM镉处理rPT细胞、5 μM和10 μM镉处理NRK-52E细胞12 h,线粒体凋亡途径相关蛋白Cyt C、Cleaved caspase-9和Cleaved caspase-3表达水平变化,内质网凋亡途径相关蛋白ATF-6、GRP78、IRE1α和Cleavedcaspase-12表达水平变化,Fas/FasL凋亡途径相关蛋白Fas、FasL、FADD、Cleavedcaspase-8表达水平变化。结果表明,2.5μM和5μM镉处理rPT细胞、5μM和10μM镉处理NRK-52E细胞6h,细胞凋亡率最低(P<0.01),6h之后凋亡率开始升高,12h细胞凋亡率最高(P<0.01);2.5μM和5μM镉处理rPT细胞、5μM和10 μM镉处理NRK-52E细胞12 h,与对照组相比,线粒体凋亡途径、内质网凋亡途径、Fas/FasL凋亡途径相关蛋白表达水平都显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01)。体内试验选择SD大鼠32只,随机分为4组:对照组(DDW)和镉组(CdAc2,50 mg/kg·bw),饲养1周;对照组(DDW)和镉组(CdAc2,50mg/kg·bw),饲养8周。饲养1周后取肾脏皮质,RT-PCR法检测凋亡基因Caspase-3表达量变化;免疫印迹法检测凋亡蛋白Cleaved caspase-3表达水平变化。饲养8周后取肾脏皮质,RT-PCR法检测线粒体凋亡途径相关基因Cyt C、Caspase-9和Caspase-3表达量变化,内质网凋亡途径相关基因ATF-6、GRP78、IRE1α和 Caspase-12 表达量变化,Fas/FasL 凋亡途径相关基因 Fas、FasL、FADD、Caspase-8表达量变化;线粒体凋亡途径相关蛋白Cyt C、Cleaved caspase-9和Cleaved caspase-3表达水平变化,内质网凋亡途径相关蛋白ATF-6、GRP78、IRE1α和Cleaved caspase-12 表达水平变化,Fas/FasL 凋亡途径相关蛋白 Fas、FasL、FADD、Cleaved caspase-8表达水平变化。结果表明,镉染毒处理1周,与对照组相比,大鼠肾脏皮质细胞凋亡无显著变化(P>0.05);镉染毒处理8周,与对照组相比,线粒体凋亡途径、内质网凋亡途径、Fas/FasL凋亡途径相关基因和蛋白表达水平都显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01)。体外和体内研究表明,低剂量镉短时间处理激活细胞的保护机制,减少细胞凋亡,而长时间处理则同时激活线粒体凋亡途径、内质网凋亡途径和Fas/FasL凋亡途径,诱导细胞发生凋亡。3.镉诱导细胞自噬与细胞凋亡的关系采用机械筛网结合酶消化法建立原代大鼠肾小管上皮细胞(rPT cells)培养模型,在传一代细胞增殖活性最强时间进行处理。流式细胞术检测自噬抑制剂3-MA对镉处理rPT细胞6h凋亡率的影响、自噬激活剂RAPA对镉处理rPT细胞12h凋亡率的影响;免疫共沉淀法检测2.5 μM和5 μM镉处理rPT细胞6 h,Beclin-1与线粒体凋亡途径相关蛋白Cyt C、Caspase-3、Cleaved caspase-3、Caspase-9、Cleaved caspase-9、Bcl-2、Bax,与内质网凋亡途径相关蛋白 ATF-6、GRP78、IRE1α、Caspase-12、Cleavedcaspase-12 及 Fas/FasL 凋亡途径相关蛋白Fas、FasL、FADD、Caspase-8、Cleavedcaspase-8的相互作用;免疫印迹法检测Beclin-1敲减对镉诱导的自噬和凋亡的影响;DCFH-DA探针法检测镉诱导ROS生成量的变化;透射电子显微镜检测包裹线粒体的溶酶体数量变化。结果表明,自噬抑制剂3-MA极显著促进镉诱导rPT细胞凋亡(P<0.01),同时自噬激活剂RAPA极显著抑制镉诱导rPT细胞凋亡(P<0.01);2.5 μM和5 μM镉处理rPT细胞6 h,Beclin-1与线粒体凋亡途径相关蛋白CytCcyto、Caspase-9、Caspase-3、Baxmito,与内质网凋亡途径相关蛋白Caspase-12,与Fas/FasL凋亡途径相关蛋白Cleaved caspase-8存在明显相互作用,与Bcl-2Totai和Bcl-2Mito也存在明显相互作用,但呈负相关剂量效应关系,与其他蛋白不存在或仅存在极微弱相互作用;Beclin-1敲减导致LC3Ⅱ蛋白表达极显著下降(P<0.01),p62蛋白表达极显著升高(P<0.01),Cleavedcaspase-12、Cleavedcaspase-8、Cleavedcaspase-3表达极显著升高(P<0.01);2.5 μM Cd和5 μM Cd处理rPT细胞6 h,5 μM镉组与2.5 μM镉组相比,ROS 水平显著降低(P<0.05),包裹线粒体的溶酶体数量显著增多(PP<0.05)。说明,自噬在镉诱导rPT细胞凋亡过程中通过Beclin-1发挥保护作用,同时通过清除受损线粒体、降低ROS水平发挥保护作用。