大量流行病学研究表明环境细颗粒物(fine particulate matter,PM_2.5)与呼吸系统疾病之间存在相关性。环状RNA（circRNA）具有高度稳定和组织特异等特点,已被证实参与多种疾病的发生发展过程。在本课题研究中,通过circRNA Microarray技术发现PM_2.5暴露前后COPD患者血浆中差异表达的circRNA,并在COPD人群血浆中进行验证。建立HBE细胞体外PM_2.5暴露模型和小鼠体内PM_2.5染毒模型,以此来开展circRNA功能研究。此外,我们通过蛋白质谱（iTRAQ法）技术发现PM_2.5暴露前后COPD患者血浆外泌体中的差异蛋白,旨在从蛋白水平探究circRNA参与PM_2.5致COPD效应的调控作用。一、PM_2.5暴露致COPD患者血浆中circRNA表达谱改变1.通过circRNA Microarray分析技术,探讨PM_2.5暴露前后COPD患者血浆中circRNA表达变化,结果显示,与PM_2.5暴露前相比,PM_2.5暴露后COPD患者血浆中21个circRNA差异表达,其中15个circRNA表达上调,6个circRNA表达下调（P<0.05）。2.在南京市胸科医院收集PM_2.5暴露前后的COPD患者血浆,选取变化倍数较为显著的circRNA即4个上调的circRNA（hsa_circ₀061265、hsa_circ₀037516、hsa_circ₀001503、hsa_circ₀005045）,1个下调的circRNA（hsa_circ₀028173）,通过qRT-PCR技术,在34对COPD患者血浆中进行验证。结果表明hsa_circ₀061265、hsa_circ₀037516、hsa_circ₀001503、hsa_circ₀005045均显著上调,hsa_circ₀028173显著下调,qRT-PCR结果与circRNA Microarray结果具有一致性（P<0.05）。3.进一步扩大样本量至98对,选取上述验证的circRNA中变化倍数较为显著的hsa_circ₀005045进一步验证,qRT-PCR结果显示,PM_2.5暴露前后的COPD患者血浆中hsa_circ₀005045表达显著上调（P<0.001）。二、hsa_circ₀005045在体内外染毒模型中的表达1.Circbase和UCSC数据库显示hsa_circ₀005045位于人2号染色体短臂上,其来源于RTN4基因。通过胞质分离实验可知hsa_circ₀005045主要集中在细胞质中,根据琼脂糖凝胶电泳和sanger测序结果可知,hsa_circ₀005045在细胞质内由RTN4基因的第二和第三外显子反向剪切形成,以环状的形式存在于血浆中,且其剪切位点的碱基分别是G和T。2.通过人支气管上皮细胞（HBE）长期染毒,PM_2.5浓度剂量为0、100和500μg/ml,建立HBE体外PM_2.5暴露模型,观察细胞形态和不同代数细胞的增殖情况。3.分别取不同暴露代数的细胞（P9、P12、P15）,采用CCK-8法检测并观察其增殖能力的改变,结果表明随PM_2.5暴露代数的增加,暴露组的细胞增殖能力呈上升趋势。与对照组相比,100和500μg/ml剂量组的细胞增殖能力在12代后均出现显著差异,且差异随代数增加而增大。因此后续的细胞分子试验选择长期暴露P15的细胞进行（P<0.05）。4.选取经PM_2.5长期暴露（P15）的HBE细胞进行qRT-PCR实验,结果显示hsa_circ₀005045表达水平在HBE细胞中发生了变化,与对照组相比,经PM_2.5暴露后hsa_circ₀005045表达显著上调,其亲本基因RTN4表达显著下调（P<0.05）。5.小鼠气管滴注PM_2.5,诱导小鼠COPD样改变模型的建立。通过气管滴注PM_2.5,在7、14、28天后观察小鼠肺组织病理改变,与对照组（气管滴注PBS）相比,7、14、28天后的染毒小鼠在肺组织中可观察到不同程度的肺气肿和肺泡炎,即小鼠出现COPD样病理改变（P<0.05）。6.通过NCBI-blast数据库比对可知,人源性hsa_circ₀005045和鼠源性mmu_circ₀002590的碱序列有91%的匹配且具有共同的亲本基因RTN4（Rtn4）,即可以认为人和鼠的circRNA具有同源性。琼脂糖凝胶电泳结果和sanger测序结果显示,mmu_circ₀002590同样是以环状的形式存在于血浆中,且其剪切位点的碱基分别是A和C。7.进一步验证mmu_circ₀002590在PM_2.5染毒小鼠的血浆中的表达。通过内眦取血获得染毒小鼠的血浆,应用qRT-PCR技术在小鼠的血浆中验证mmu_circ₀002590的表达,经结果分析可知,在PM_2.5暴露7天,14天,28天后血浆中的mmu_circ₀002590表达均出现上调（P<0.05）。三、hsa_circ₀005045生物学功能的探索1.通过蛋白质谱（iTRAQ法）资料,研究PM_2.5暴露的COPD患者血浆外泌体中蛋白质的表达情况,以此来判断蛋白的改变。结果显示PM_2.5暴露引起66个差异表达的蛋白,其中30个表达上调,36个表达下调（FC≥1.2且P<0.05）,多肽的片段数集中分布在7-13之间,蛋白质质量分布在0-200 KDa之间。通过蛋白互作信息图（PPI）可知,ELANE,PRDX2,CA2是蛋白互作网络中结点数量最高的上调蛋白,TTR,KNG1和APOC3是蛋白互作网络中结点数量最高的下调蛋白,为后续研究提供了一定的基础。2.选取ELANE和PRDX2作为目标蛋白,进一步研究其与hsa_circ₀005045及COPD之间的关系。ELISA结果显示,16对COPD患者血浆中ELANE,PRDX2在PM_2.5暴露后的表达水平显著上调,与蛋白质谱结果具有较好的一致性（P<0.05）。3.选取经PM_2.5长期暴露（P15）的HBE细胞进行Western Blot实验,结果显示PRDX2蛋白在PM_2.5染毒的HBE细胞中随着PM_2.5浓度的增加呈现上升的趋势（P<0.05）。ELANE主要由中性粒细胞、巨噬细胞等炎性细胞分泌,因此,HBE细胞中未观察到ELANE蛋白表达。4.选取经PM_2.5暴露的出现COPD样改变的小鼠进行免疫组化实验,结果显示PRDX2和ELANE在PM_2.5所致的COPD模型中呈现高表达。与对照组相比,在小鼠PM_2.5暴露7天,14天,28天的肺组织中PRDX2和ELANE表达显著上调（P<0.05）。5.通过在线软件RPISeq对hsa_circ₀005045与PRDX2的相互作用进行预测。结果显示hsa_circ₀005045与PRDX2结合的Prediction using RF classifier和Prediction using SVM classifier分数分别是是0.55和0.80。hsa_circ₀037516与PRDX2结合的Prediction using RF classifier和Prediction using SVM classifier分数分别是0.60和0.83。结果说明hsa_circ₀005045和hsa_circ₀037516与PRDX2之间可能存在相互作用,且具有较强的可信度。综上所述,我们发现了在PM_2.5暴露前后COPD患者血浆中hsa_circ₀005045表达上调,并在细胞和动物水平进行了验证。hsa_circ₀005045可能通过与外泌体蛋白PRDX2、ELANE结合并参与调控PM_2.5致COPD的过程。因此本研究认为,hsa_circ₀005045可以作为PM_2.5暴露引起COPD发展的分子标志,为PM_2.5暴露引起的呼吸损伤修复及的早期发现及干预提供了新的研究方向。