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研究背景及目的:干细胞研究是目前生物医学研究的前沿领域,有着广阔的应用前景,诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)因可由体细胞重编程获得,回避了胚胎多能干细胞(embryonic stem cells,ESCs)应用时的伦理争议,因此应用前景更广。如何提高iPSCs诱导效率以及精确调控细胞定向分化问题是该项技术推广和应用的瓶颈。越来越多的证据表明长链非编码RN A(1 n cRN A)在细胞命运决定及体细胞重编程方面发挥了重要的调控作用,但具体哪些lncRNA,以何种方式在iPSCs诱导及定向分化过程中行使功能,需要我们更深入的研究和探索。为寻找具有多能性潜能的lncRNA,本研究综合了多个测序结果筛选出一条全新的与多能基因Oct4启动子结合,与多能性退出相关的lncRNA,并将其命名为 Pluripotency exit-associated lncRNA 1,简称 Peln1。发现Pelnl在重编程中呈差异表达,将Pelnl敲除可提高重编程效率;若将Pelnl过表达,则无法维持iPSCs的干性,细胞发生分化。提示Pelnl可能在干细胞多能性退出及体细胞重编程过程中发挥了重要作用。本研究将对Pelnl的结构,细胞定位,功能,及其调控干细胞多能性退出及体细胞重编程的具体机制做进一步研究,最终阐明以lncRNA为媒介的细胞命运调控模式;以最终达到操纵和控制细胞命运的目的,推动诱导干细胞产品的临床转化。研究方法:1、通过将未编程成功的体细胞及编程成功的iPSCs分别进行RNA测序,比较两个RNA-Seq数据库,筛选出在未编程成功的体细胞中高表达的lncRNA;再利用“染色质lncRNA原位逆转录测序”(chromatin lncRNA in situ reverse transcription-associated trap sequencing,简称CLIST-Seq)方法,筛查与多能基因Oct4启动子结合的多能性退出相关lncRNA,综合以上两个数据库,挑选出多能性退出相关lncRNA Peln1,再通过“RNA逆转录结合捕获测序技术”(RNA reverse trancription-associated trap sequencing,RAT-seq)反向验证,验证lncRNA Peln1在基因组中与DNA结合的靶点。2、通过逆转录PCR(RT-PCR)的方法检测lncRNAPeln1在重编程过程中及在不同细胞及组织中的表达差异;通过拟胚体分化实验观察lncRNA Peln1在胚胎干细胞分化过程中的表达变化及与其它多能因子的关系;应用核内核外分离实验及RNA FISH实验两种办法来确定它的亚细胞定位;应用RACE(rapid-amplification of cDNA ends,cDNA 末端快速扩增技术)来获得 lncRNA Peln1的全长信息。3、利用过表达实验、敲低实验及重编程实验来验证1 n cRNA Peln1的功能:合成lncRNA Peln1过表达质粒并转染小鼠胚胎干细胞E14后观察细胞形态变化及对多能性基因表达的影响;合成lncRNA Peln1 shRNA敲低质粒,转染需DOX诱导的含有OSKM四因子的小鼠成纤维细胞(DOX-OSKM-MEFs),使得lncRNAPelnl不能表达,再进行诱导重编程实验,观察重编程效率是否有所改善。4、通过RAT技术及RNA-DNA荧光原位杂交技术(RNA-DNA Fluorescence in situ hybridization,RNA-DNA FISH)验证 lncRNA Peln1的作用靶点;应用染色质构象捕获技术(chromosome confirmation capture,3C)验证 lncRNA Peln1对染色质空间结构的影响;通过甲基化实验验证lncRNA Peln1对Oct4启动子区甲基化的影响,应用染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)、RNA 结合蛋白免疫沉淀技术(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)及RNA-蛋白体外孵育等方法明确lncRNA Peln1调控Oct4表达的具体机制。研究结果:1、结合CLIST-Seq及RNA-Seq两个数据库,筛选出多能性退出相关lncRNA Peln1:RNA-Seq结果显示lncRNA Peln1在未编程成功的体细胞中与iPSCs中差异表达,在未编程成功的体细胞中表达量较高,CLIST-Seq结果显示lncRNA Peln1特异性的富集于多能因子Oct4的启动子区。RAT-seq反向验证结果显示多能基因Oct4的启动子及3’增强子区域皆与lncRNA Peln1有较强的结合。2、RT-PCR结果提示lncRNA Peln1在重编程的过程中呈差异性表达,在iPSCs及E14中lncRNAPeln1几乎不表达,而在未重编程成功的细胞及体细胞中lncRNA Peln1高表达拟胚体分化实验结果显示lncRNA Peln1随着干细胞的分化而表达上调,与Oct4,Sox2,Nanog等多能因子的表达趋势相反;亚细胞定位实验提示Peln1位于细胞核内。通过RACE技术获得lncRNA Peln1全长序列信息,3’端序列与目前网站提供的一致,5’端序列与网站报道略有差别。3、在过表达实验中,当在多能干细胞中增加lncRNA Peln1的表达水平时,关键性多能性基因Oct4,Sox2,Nanog等的表达水平均下降,且E14发生分化,Oct4免疫荧光染色为阴性,细胞难以维持多能性;在敲低实验中,在重编程的早期敲低lncRNA Peln1可提高重编程效率,且提高形成iPSCs的多能性。4、RAT实验及RNA-DNA FISH实验证明了 Oct4是lncRNA Peln1的作用靶点,lncRNA Peln1可结合于Oct4的启动子及3’增强子区域;3C实验显示在E14细胞中,Oct4启动子与3’增强子区域在空间上可形成染色质内环结构,而在E14细胞过表达了 lncRNA Peln1后这种空间结构遭到破坏;甲基化实验证明了过表达lncRNA Peln1后,E14细胞Oct4启动子区甲基化水平增加;ChIP实验证明了 lncRNA Peln 1可促进DNMT3 a结合到Oct4启动子及3’增强子区域;RIP实验进一步证实了 lncRNA Peln1可与DNMT3a结合且提示lncRNA Peln1的3’端与DNMT3a甲基化酶结合的更明显;RNA-蛋白体外共孵育试验也证明了 lncRNA Peln1可与DNMT3a结合,且结合的区域为lncRNA Peln1的3’末端。研究结论:1、lncRNAPeln1是一条位于小鼠6号染色体上的全新的lncRNA,它位于细胞核内,在体细胞重编程的过程中呈差异表达,在干细胞多能性退出的过程中表达量逐渐增多,与多能因子Oct4,Sox2,Nsnog等的表达呈负相关。2、lncRNA Peln1有促进干细胞多能性退出的作用,过表达lncRNA Peln1后E14发生分化,难以维持多能性,且关键多能性基因表达随之下调。lncRNA Peln1亦有阻碍重编程的作用,在重编程的早期敲低lncRNA Peln1可提高重编程效率,且提高形成iPSCs的多能性。3、Oct4 为 lncRNA Peln1的作用靶点,lncRNA Peln1通过招募 DNMT3a甲基化酶,破坏Oct4启动子及3’增强子之间的染色质内环结构,促进Oct4启动子区域DNA甲基化等机制调控Oct4表达。创新点:1、研究“对象”新。目前lncRNA在重编程中的研究尚属起步阶段,本研究首次发现与多能相关基因Oct4启动子与增强子结合,且在重编程过程中差异表达、位于小鼠六号染色体上的全新lncRNA,我们将其命名为Pluripotency exit associated lncRNA1,简称Peln1,本研究首次证实Peln1可以促进iPSC多能性退出,影响重编程效率。2、研究“机理”新。本课题以“lncRNA-染色质内环结构-干性基因调控-多能性退出”这一调控网络系统为主线,首次阐明Peln1与Oct4启动子及增强子DNA相互作用,影响染色质内环形成,并招募DNA甲基化酶,影响多能因子Oct4的表达,为提高体细胞重编程效率及操控干细胞分化提供新的思路。