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本研究利用RT-PCR和RACE技术,克隆了‘琯溪蜜柚’果实中黄烷酮-3-羟化酶(F3H)的cDNA全长以及查尔酮合成异构酶(CHI),查尔酮合成酶(CHS)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)cDNA的保守序列。这些类黄酮合成关键基因的克隆,为柚子果实类黄酮合成机理研究奠定了分子生物学基础。研究结果如下:1.利用RT-PCR和RACE进行F3H cDNA全长的克隆F3H cDNA全长为1302bp,开放阅读框能够编码362个氨基酸(Mw=40.497 kDa, pI=5.97)。利用NCBI进行基因和蛋白质Blast,结果发现F3H的cDNA全长,该序列与柳橙(Citrus sinensis)、龙眼(Dimocarpus longan)、陆地棉(Gossypium barbadense)、海岛棉(Gossypium hirsutum)、葡萄(Vitis vinifera)同源性也比较高,分别为97%、87%、86%、85%、84%;蛋白质序列与柳橙(Citrus sinensis)、龙眼(Dimocarpus longan)、陆地棉(Gossypium barbadense)、海岛棉(Gossypium hirsutum)、葡萄(Vitis vinifera)同源性也比较高,分别为97%、87%、86%、85%、84%。对克隆基因编码蛋白质保守序列的预测,该基因包括20G-FeII-Oxy高度保守区域,该结构域具有赖氨酸水解酶、异青霉素合成酶和AlkB活性,该保守结构决定了该酶具有催化类黄酮合成的功能。该序列的GenBank登录号为: GQ121373。2.利用RT-PCR和RACE进行CHI cDNA保守序列的克隆克隆得到CHI基因的cDNA保守片段,长度782 bp,利用Blast比对软件,发现‘琯溪蜜柚’果实的CHI基因与甜橙(Citrus sinensis)、温州蜜柑家族(Citrus reticulata) CHI的cDNA基因同源性很高,达到96%、95%,与毛果杨(Populus trichocarpa)、西洋梨子(Damson pear)、草莓(Fragaria ananassa)、圆叶牵牛(Ipomoea purpurea)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)的cDNA的同源率分别为79%、78%、77%、74%、68%。编码蛋白质的保守序列发现,该基因具有Chalcone superfamily的保守序列,该保守序列与CHI基因催化类黄酮物质的合成有关。该序列的GenBank登录号为: FJ976039。3.利用RT-PCR进行CHS cDNA保守序列的克隆克隆得到一段长280 bp的CHS基因的保守序列,该基因与野茶树的CHS基因具有较高的同源性,推测编码蛋白质保守结构域为cond-enzymes家族,属于缩合酶家族,催化类似于重排(脱羧基或者非脱羧基)反应的酶促反应。这个家族有很强的结构相似性,也参与脂肪酸的合成和降解反应,产生聚酮化合物。在类黄酮物质的合成过程中,CHS的主要功能是催化从4-香豆酸CoA和丙二酰CoA合成查尔酮的酶促反应。该序列的GenBank登录号为:GU932717。4.利用RT-PCR进行PAL cDNA保守序列的克隆克隆得到一段长875 bp的PAL基因的保守序列。通过与其他植物PAL基因的比对,发现与其他一些植物具有较高的同源性。预测该基因编码的蛋白质具有一个保守结构域PAL-HAL,该结构域能催化苯基丙氨酸形成苯丙烯酸。该序列的GenBank登录号为:GQ125373。