目的弥漫性轴索损伤（DAI）是由于头部的旋转或加速力导致神经轴索及血管破裂为特征的严重的创伤性脑损伤（TBI）。由于DAI缺乏早期诊断标准,且无特异治疗方法,多数患者预后不良,其死亡率超过40%。目前,DAI的治疗手段主要包括脱水剂、自由基清除剂、脑疝危象时行开颅减压术、并发症防治及神经营养药物等综合治疗措施,其中最常见的是药物治疗。因此,深入了解DAI的发生机制,加深对DAI超早期病理生理过程的认识,对发现具有更好疗效和安全性的治疗方法至关重要。DAI疾病发生过程中,钙超载是公认的机制之一。TRPC6作为非选择性阳离子通道,在神经系统中广泛表达,其是否参与神经损伤的钙调控,仍有待研究。本研究旨在明确TRPC6在机械力导致神经元损伤中的表达与功能,阐明其促进弥漫性轴索损伤发生的分子机制,探讨TRPC6抑制剂在DAI过程中的神经保护作用,为DAI的治疗提供理论和实验依据。方法1.DAI动物模型:选取300±20g的雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠,随机分为假手术组（Sham）、SKF组（SKF）、打击组（Force）和SKF治疗组（Force+SKF）。使用Marmarou装置打击大鼠,建立DAI模型;Sham组和SKF组大鼠每天分别单独腹腔注射35mg/kg生理盐水和5mg/kg SKF。Force+SKF组大鼠首先给予5mg/kg SKF,2h后进行垂直重力打击实验。Force组仅进行垂直重力打击。每日观察并对各组大鼠神经功能进行评分。2.神经细胞机械力损伤模型:原代脑皮质神经细胞培养成熟后随机分为对照组（Control,Cnt）、GsMTx-4组（GsMTx-4）、机械力组（Force）和GsMTx-4治疗组（Force+GsMTx-4）。Force组神经细胞在正常培养条件下培养至第6天,给弹力膜加载机械力构建机械力损伤细胞模型,实现体外模拟DAI过程。Force+GsMTx-4组神经元细胞培养至第6天更换含有GsMTx-4的培养基,培养6h后进行机械力损伤（制造模型）。每日观察轴突形态并拍照记录。3.用Western blot和IF方法检测脑组织和神经细胞中的TRPC6的表达和分布。4.用激光共聚焦显微镜检测胞质内钙离子浓度,在机械力损伤过程中监测Ca2+浓度变化。5.在细胞模型上,通过Western blot分别检测各组神经细胞CaMKⅡβ、p-CaMKⅡβ蛋白表达水平。6.在细胞模型上进行α-Tubulin免疫荧光染色,观察加载机械力的神经细胞在给予TRPC6抑制剂前后的形态变化。7.在动物模型成功24小时后,麻醉取脑组织,固定后切片,进行尼氏染色,通过尼氏染色观察各组大鼠皮质及海马区域神经元缺失状况。结果1.Western blot结果显示:与Control组相比,Force组神经细胞TRPC6蛋白表达水平上升。2.免疫荧光检测:TRPC6蛋白主要表达在神经细胞的细胞膜和细胞质中。机械力损伤后,神经细胞的TRPC6与α-Tubulin共定位面积较对照组增加。3.细胞质内钙离子浓度测定:神经细胞在加载机械力瞬间胞质内钙离子浓度升高,给予TRPC6通道抑制剂处理时,升高的钙离子被抑制,表明神经细胞损伤过程与TRPC6通道激活具有相关性。4.Western blot结果显示:DAI发生时,Ca2+/CaMKⅡβ通路被激活,而TRPC6通道抑制剂可显著抑制Force组的钙离子升高,并下调原代脑皮质神经元CaMKⅡβ,p-CaMKⅡβ的蛋白表达水平。5.神经元形态分析:对Control组、Force组、GsMTx-4组、Force+GsMTx-4组进行神经元形态分析、计算并比较神经元突起数量,观察神经元形态变化。Force组与Force+GsMTx-4组在加载机械力30min内,光镜下观察到神经元细胞均呈现轴突卷曲、增粗,甚至断裂。随着时间的推移,未断裂的轴突逐渐恢复形态。再使用α-Tubulin进行免疫荧光染色分析,结果表明:与GsMTx-4干预组相比,Force组神经细胞轴突断裂较多,呈毛刺样改变,神经细胞突起数目显著减少。GsMTx-4干预组的神经细胞突起较Force组显著增多。6.m NSS神经功能评分显示:与Force组大鼠相比,SKF干预后可在早期降低m NSS评分,改善神经功能。Sham组和单独给予SKF组大鼠神经功能正常。7.尼氏染色:Force组皮质区神经元呈不规则分布,胞浆皱缩,细胞核呈三角形状固缩,Force+SKF组可见神经元缺失明显减少。Sham组和SKF组,神经元存活无明显差异。结论弥漫性轴索损伤大鼠的神经元TRPC6表达增高,TRPC6通过调控细胞质内钙离子浓度,激活Ca2+/CaMKⅡβ通路,参与弥漫性轴索损伤的发生与发展。