【摘 要】
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目的:本研究主要通过构建并包装干扰人肝癌衍生生长因子(human hepatoma-derived growth factor,hHDGF)表达的短发卡 RNA(short haircut RNA,shRNA)慢病毒,在体外条件下探究
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目的:本研究主要通过构建并包装干扰人肝癌衍生生长因子(human hepatoma-derived growth factor,hHDGF)表达的短发卡 RNA(short haircut RNA,shRNA)慢病毒,在体外条件下探究下调HDGF表达水平对前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响,并进一步探讨其潜在的可能机制,为阐明前列腺癌发生进展机理和探寻前列腺癌新的临床诊断和治疗方法及预后判断指标提供新的线索和方向。方法:根据hHDGF的干扰靶点构建干扰HDGF表达的shRNA及其对应的含无意义序列的shRNA,包装成慢病毒并纯化后转染体外培养的前列腺癌细胞株DU145、PC3和LNCaP,并用含嘌呤霉素的细胞培养液培养病毒转染细胞以获得稳定转染的细胞系。每种细胞分为3组:①空白对照组(PBS):PBS处理细胞;②阴性对照组(shRNA-CTR):含无意义序列的慢病毒转染细胞;③实验组(shRNA-HDGF):含靶序列的慢病毒转染细胞。建立稳定转染细胞系后,运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测hHDGF mRNA表达水平,CCK-8实验和细胞克隆形成实验分别检测细胞生长和增殖能力,细胞划痕实验和Transwell迁移实验检测细胞迁移能力,Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力,Western blotting检测细胞内相关蛋白的表达水平,包括PI3K-AKT-mTOR信号通路中的相关蛋白、与上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)有关的相关蛋白及基质金属蛋白酶(MatrixMetalloproteinases,MMPs)中MMP2、MMP9等。结果:成功构建干扰HDGF表达的慢病毒载体并建立稳定转染慢病毒的前列腺癌细胞株,qRT-PCR和Western blotting结果显示hHDGF mRNA和蛋白表达均被抑制(P<0.05),CCK-8实验和细胞克隆形成实验均显示细胞生长和增殖能力下降(P<0.05),细胞划痕实验和Transwell迁移实验均显示细胞迁移能力下降(P<0.05),Transwell侵袭实验示细胞侵袭能力下降(P<0.05),Western blotting示P13K-AKT-mTOR信号通路中的相关蛋白磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(P-AKT)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(P-mTOR)表达均下降(P均<0.05),与EMT有关的N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、锌指转录因子Snai和锌指转录因子Slug的表达也均下降(P均<0.05),而E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达升高(P<0.05)。另外,Western blotting还发现,基质金属蛋白酶(MMPs)中MMP2、MMP9的表达也下降(P<0.05)。结论:HDGF表达下调对前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力具有抑制作用,而且该抑制作用可能与PI3K-AKT-mTOR信号通路失活、EMT被抑制及MMP2、MMP9的表达水平下降有关。
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