绵羊肌动蛋白γ家族基因的克隆、结构特征及组织表达分析

来源 :山东农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:glx19891006
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绵羊肌动蛋白γ家族(Actin-gamma)基因包括肌动蛋白γ1(ACTG1)、肌动蛋白γ2 (ACTG2)。本试验以小尾寒羊和杜泊羊为试验材料,采用RT-PCR、RACE、生物信息学分析、荧光定量PCR、Western Blot等技术方法,克隆了绵羊ACTG1、ACTG2基因的全长序列,预测分析了其对应的蛋白序列特征和功能特性,检测了其在小尾寒羊和杜泊羊多种组织的表达,从mRNA水平和蛋白水平上探索了绵羊两个基因的表达特性。结果如下:  (1)小尾寒羊ACTG1、ACTG2基因cDNA序列全长的克隆,包括保守区、3' UTR和5' UTR。编码的氨基酸长分别为375、376个氨基酸。并将所克隆的基因序列与NCBI数据库的预测序列进行了比对,ACTG1存在三个突变位点,ACTG2存在两个突变位点。  (2)生物信息学分析显示,两蛋白为偏酸性蛋白,且结构比较稳定,亲水性比较好,ACTG1蛋白含有的异亮氨酸(7%)比ACTG2(8%)少,因此ACTG1蛋白比ACTG2亲水性更强。两蛋白的流动性比较大,均没有跨膜结构域,含有多个磷酸化位点和糖基化位点,预测为非分泌性蛋白质。二级结构主要以无规则卷曲为主分别占63.2%、64.9%。三级结构预测,ACTG1三级结构最佳模板为人类肌动球蛋白-原肌球蛋白(cytoplasmic actomyosin , ATM)复合物, ACTG2预测其三级结构为兔的 α-骨骼肌肌动蛋白(Actin, alpha skeletal muscle)。ACTG2为该结构蛋白中Chain:a, b, c, d, e, f, g, h, i, j.中的b链(PDB id:3J8K.1.B)  (3)多种氨基酸序列比对显示:γ肌动蛋白的氨基酸序列在所选用的比对物种中高度保守。系统进化树显示,绵羊的ACTG1蛋白与山羊、人类、野猪遗传距离最近。绵羊ACTG2蛋白与山羊、野猪、野牛、黑线仓鼠、鼹鼠、狐蝠遗传距离最小,与鸿雁遗传距离最远。上述结果表明,两蛋白均与哺乳动物中遗传关系较近。  (4)采用qRT-PCR试验方法检测ACTG1和ACTG2基因在小尾寒羊和杜泊羊多个组织中的mRNA的表达水平。显示,ACTG1在胰脏、胃组织中高表达,显著高于其他组织(p<0.05),其次是卵巢、脾脏、肺脏,其中在胃组织中小尾寒羊的表达量显著高于杜泊羊(p<0.05)。总的来说,ACTG1基因几乎在所有组织中均表达。ACTG2基因在心脏、脾脏中高表达,显著高于其他组织(p<0.05),其次是肺脏、卵巢,其中在心脏组织中小尾寒羊表达量显著高于杜泊羊(p<0.05),在卵巢组织中杜泊羊的表达量显著高于小尾寒羊(p<0.05)。  (5)两蛋白在各个组织中的表达存在差异。发现两γ肌动蛋白的分子量大小均为48KD,与生物信息学分析预测的结果相近。ACTG1蛋白,在小尾寒羊的肋间肌和臂三头肌高表达,在杜泊羊中在肋间肌、臂三头肌、肺脏组织中高表达。ACTG2蛋白在所有之中均表达,在背最长肌、肋间肌、肺组织表达量最高,品种间表达差异不显著。  综上所述,本试验成功克隆了小尾寒羊的ACTG1、ACTG2基因的cDNA全长序列,从不同的角度对两种蛋白的结构、功能和组织表达特异性进行了分析,旨在从分子水平探究两个基因的功能特点。为后续探究基因的功能和分子育种提供基本的理论依据。
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