细菌纤维素(Bacterial Cellulose,BC)是一类由微生物产生的纯纤维素,是葡萄糖单体分子以β-1,4-糖苷键聚合而成的高分子聚合物。具有优良的生物亲和性、生物相容性、生物适应性和良好的生物可降解性,被公认为世界上安全的性能优异的新型生物材料。在食品、造纸、声学器材、石油开采和人造皮肤、医用材料等领域有广泛的应用前景。细菌纤维素非直接合成途径中产生的大量代谢副产物是影响产量提高的一个重要原因,限制了细菌纤维素产物进一步提高。本文基于当前问题,采用外源添加酸的方法,主要应用GC-MS分析手段对酸扰动下汉氏葡糖醋酸杆菌发酵产细菌纤维素过程的胞外代谢组研究,考察酸扰动对菌体生理代谢及细菌纤维素产物合成的影响。主要研究结果如下:应用单因素实验对GC-MS方法关键程序进行优化,并从精密度、重复性和稳定性上进行方法学考察。最终得出最优化的分析条件:进样口温度为300℃,色谱条件为:80℃保持2min、2℃/min升温至165℃保持2min、1℃/min升温至180℃保持2min、20℃/min升温至300℃;分流比为10:1。质谱离子源电压为70eV,全扫描范围为50-600,离子阱温度220℃、传输线温度280℃,电子倍增器电压为100mV,溶剂延迟时间为3min。同时实验也表明,仪器的稳定性较为良好,且在12小时内样品稳定、实验重现性好。应用构建成功的GC-MS方法体系,测定得到总离子流图,为了确定胞外代谢物,结合NIST08质谱库比对,对检测到的谱峰进行鉴定,推测可能的代谢物的种类。筛除可能性比较低的谱峰,从中可以确定比较明显的10个代谢物,包括糖类和酸,这些代谢物将应用在下一步代谢模式转变中考察中。应用PCA得分图比较分析了不同菌株的代谢物图谱变化,高产菌株M和Co-5菌株代谢产物及需求基本类似,距离更为相近;而低产菌株Br-12生理代谢与其他两株差异更大一些,与前两者距离较远。从其代谢状况上反应出Br-12、M、Co-5菌株的细菌纤维素产量类似的“顺时针”变化轨迹,即不同菌体的代谢物图谱表现出低产、正常、高产的变化过程。对比表明菌体代谢模式和菌体基因型可能是影响不同菌株代谢物图谱变化的主要因素。同时利用载荷图表征了代谢物对菌株分类的贡献,发现葡萄糖、葡萄糖醛酸、尿苷、肌醇对菌株分类的贡献较大,说明这些代谢物在菌体生理代谢和酸耐受性方面具有重要作用。比较分析了酸扰动对不同菌体代谢物图谱变化的影响。结果表明酸扰动对Br-12和M菌株的影响类似,pH4和pH7的样本基本分开,但pH4时,代谢途径酸调控样本基本聚在一起,盐酸扰动样本与代谢途径酸调控样本不在同一区域。表明酸扰动可以影响Br-12和M菌体的生理代谢及产物合成,但代谢途径副产物酸扰动与盐酸扰动对Br-12菌株的作用机制是不同的。在pH7条件下,不同的酸添加样品被分在不同的地方。表明不同的酸盐对Br-12菌体生理代谢影响机理是不同的。pH7条件下,Co-5菌株酸扰动样本在得分图中是分散的。pH4条件下,Co-5样本同样没有聚在一起,并且与pH7样本混在一起。表明Co-5有极强的酸耐受性,这种酸扰动对Co-5菌体生理代谢和产物合成过程影响较小。代谢物载荷表明葡萄糖、葡萄糖醛酸和核糖对酸扰动的菌体代谢模式贡献较大。胞外葡萄糖和核糖主要贡献了酸盐对三种菌体代谢的影响,葡萄糖醛酸可能是对pH4和pH7的分类有主要贡献。而Co-5菌体酸扰动样本的分散可能是由其独特的生理代谢特性及较强的酸耐受性决定的。聚类分析结果表明,不同酸扰动的不同菌体发酵代谢物图谱分为两大类,Br-12和M为一大类,Co-5单独一类。Br-12和M中pH4和pH7分别聚类在一起,而Co-5菌体pH4和pH7样本没有区分开。总的来看,菌体本身类型对代谢模式的影响是决定性的,对聚类分析贡献最大。酸环境即pH值同样影响了代谢物变化,但这种作用主要影响了 Br-12和M菌的代谢模式,Co-5对其不敏感。酸扰动影响菌体代谢模式,进而影响了其产物合成。与对照相比,酸扰动对不同的菌体影响不同,五种酸扰动均可增加M菌株细菌纤维素的产量,五种酸扰动在pH7条件下显著增加Co-5菌株细菌纤维素的产量,而pH4条件下,酸扰动抑制了 Co-5菌株细菌纤维素的产量。对Br-12而言,丙酮酸和乳酸、柠檬酸增加其细菌纤维素产量,其余的酸则抑制细菌纤维素的产量。总体而言酸扰动影响了细菌纤维素的合成,而且大多是对细菌纤维素合成是有益的。当前研究是从发酵环境和代谢生理考量的,酸扰动对不同菌体细菌纤维素合成的影响的生理和分子机制需要深入研究。