论文部分内容阅读
近年来,干细胞生物学和组织工程学发展迅速,这促进了再生性医学的进步。再生性医学的目的是创造功能性、有活力的组织,修复或取代受损的组织。在牙体牙髓科中,根尖牙乳头干细胞(SCAPs,stem cells from the apical papilla)是研究的热点,它存在于未发育完全的恒牙根尖周组织中,是具有高度增生自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞,被认为是牙根部成牙本质细胞的来源,最终形成牙根部牙本质。SCAPs的存在解释了一些被感染的年轻恒牙经过适当的消毒处理后,牙根仍能继续发育的现象。cAMP/PKA/CREB信号通路可以决定间充质干细胞的成骨向分化潜力。作为该通路的下游信号,CREB(c AMP responsive element-binding protein)起了关键作用,它通过附着于c AMP(cyclic Adenosine 3’,5’-monophosphate)反应基因的保守序列而发挥作用。已经发现在人类磨牙成牙本质细胞和成牙骨质细胞的细胞核内,CREB表达明显,而抑制CREB后,小鼠的软骨内骨形成减少。此外,在许多与矿化过程相关基因的启动子区域内,含有转录因子CREB在靶基因上的结合位点CRE,如骨钙素(OCN,osteocalcin),骨涎蛋白(BSP,bone sialoprotein)等。提示CREB在生物矿化的过程中起了重要作用,然而,在SCAPs中,CREB对于成牙本质/成骨分化的作用还未完全确定。目的通过慢病毒转染人根尖牙乳头干细胞(SCAPs,stem cells from the apical papilla),改变转录因子CREB(c AMP-responsive element binding protein)在SCAPs中的表达,检测对SCAPs成牙本质/成骨向分化的影响,从而探讨CREB定向调控根尖牙乳头干细胞分化的分子机制。方法分离培养人根尖牙乳头干细胞;采用有限稀释法获得克隆化细胞;流式细胞术和细胞多向分化诱导实验鉴定实验细胞的组织学来源;分别构建慢病毒载体介导的CREB基因过表达和沉默的根尖牙乳头干细胞;实时定量PCR和Western Blot检测慢病毒转染效率。预实验确立各组慢病毒MOI(Multiply of Infection)值及最佳转染条件。将细胞分组为空白对照组、阴性病毒对照组、过表达组、沉默组。将空白对照组、病毒对照组、CREB过表达/沉默组矿化诱导2周后,茜素红染色观察比较矿化结节形成的量,并半定量分析;实时定量PCR检测矿化诱导1、2、3周时,各组细胞的碱性磷酸酶(alkaline phosphateasea,ALP),Ⅰ型胶原(collagen typeⅠ,Col-Ⅰ),runt相关转录因子2(RUNX2),骨钙素(osteocalcin,OCN),osterix(OSX)的m RNA表达;对各组细胞矿化诱导3周后,Western Blot检测成牙本质特异性蛋白DSP(dentin sialoprotein)及成骨分化标志物RUNX2的表达,并进行蛋白半定量分析。结果流式细胞术和干细胞多向分化实验证实分离培养的细胞为SCAPs。实时定量PCR和Western Blot检测显示慢病毒转染SCAPs后能够有效改变目的基因CREB表达,结合荧光显微镜观察说明慢病毒具有很高的转染效率,且对细胞生长无明显影响。茜素红染色及矿化结节半定量分析显示,矿化诱导2周后,CREB过表达组形成钙结节能力增强;矿化诱导1、2、3周,CREB过表达组中的矿化标志物ALP,Col-Ⅰ,RUNX2,OCN,OSX的m RNA在各时间点几乎均上升;Western Blot检测矿化诱导3周时的细胞示,CREB过表达组DSP,RUNX2蛋白表达升高(P<0.05)。而CREB沉默组形成钙结节能力则减弱(P<0.05),且在矿化诱导4、7天时检测,矿化基因的m RNA均有不同程度的降低(P<0.05)。结论在SCAPs矿化诱导过程中,过表达CREB促进SCAPs向成牙/成骨细胞分化,而沉默CREB则发挥相反作用,提示CREB可能促进SCAPs的定向分化能力。为牙源性干细胞在牙髓/牙本质再生和生物性牙根的形成提供新的思路。