1.研究背景及意义阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是老年人群中最常见的痴呆类型。随着全球老龄人口的不断增加,其发病率及患病人数不断增加,为家庭及社会带来巨大负担。越来越多的证据指出β淀粉样肽(amyloid-beta,Aβ)在AD发病中发挥核心作用。虽然目前AD发病机制的研究已取得重大进展,但临床上仍缺乏有效的防治药物。近年来,一系列靶向Aβ的药物,如免疫疗法和β、γ分泌酶抑制剂已进入临床实验,但均未能改善AD患者的智能水平,提示单一靶点或通路的方法难以取得有效治疗效果。Aβ的过度产生及沉淀,可诱发一系列病理事件,如突触变性、Tau蛋白过度磷酸化、氧化应激、炎症反应、神经元变性和凋亡等。而这些继发性病理改变又能加重Aβ毒性,继而形成恶性循环,进一步促进AD的进展。因此,我们提出假设:寻找能够发挥多靶点或多通路作用的新药对于治疗AD具有重要意义。临床药物实验的失败经验告诉我们,未来临床试验中,药物的选择必须同时兼顾安全与靶向。从已有药物中筛选AD治疗药物是目前行之有效的一个方法。本文中,我们应用此策略,选择氧自由基清除剂依达拉奉作为研究对象,探讨其对阿尔茨海默病的防治作用及可能机制。氧化失衡是AD的病理表现之一,甚至早于Aβ沉淀和神经纤维缠结(neurofibrillary tangle,NFT)。Aβ是一种具有高度氧化还原活性的肽,能够产生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS),而ROS是促进Aβ恶性循环及脑内扩布的物质之一。既往研究发现依达拉奉能够改善Aβ诱导的氧化应激和神经毒性。Aβ聚集沉淀形成老年斑是AD发生的使动因素。在本研究中,我们发现依达拉奉能够与Aβ作用,抑制Aβ聚集和解聚已成形的Aβ纤维,提示依达拉奉是Aβ和ROS共同的清除剂。动物实验中,我们发现依达拉奉,在Aβ脑内沉淀之前或之后给药,均能通过抑制Aβ沉淀,减少APP的β剪切,减轻脑实质和脑血管中Aβ水平,降低氧化应激和神经炎症水平,抑制tau磷酸化,阻止神经元丢失和突触变性,最终改善老龄APPswe/PS1dE9(APP/PS1)小鼠的智能缺损。2.材料与方法Aβ聚合和解聚实验。应用硫磺素T(Thioflavin T,ThT),免疫蛋白印迹(Western blot)和透射电镜(transmissionelectronmicroscopy,tem)方法进行aβ聚合和解聚实验。依达拉奉结合位点测定应用tht实验进行。神经毒性实验和轴突生长实验。sh-sy5y细胞用于mtt、轴突生长实验及依达拉奉作用后tau磷酸化和gsk3β活性的检测。原代培养皮层神经元用于轴突生长实验、碘化丙啶(pi)实验和ros测定。sh-sy5y-app695细胞用于检测依达拉奉对bace1表达和app代谢的影响。药动学实验。4月龄成年大鼠给予10mg/kg依达拉奉腹腔注射或口服给药,应用高效液相色谱-串联质谱联用法(lc-ms/ms)测定依达拉奉的生物利用度,进而推算口服给药剂量。动物实验及标本采集。选用app/ps1转基因小鼠为实验动物。整个实验分为两部分。第一部分,依达拉奉腹腔注射,44.1mg/kg,每日1次。预防实验中,3月龄开始给药,9月龄为终点,持续6个月;空白对照组(性别年龄匹配的app/ps1小鼠)和野生型对照组(性别年龄匹配同窝小鼠)给予相同体积的生理盐水腹腔注射。治疗实验中,9月龄开始给药,12月龄结束,持续3个月,年龄性别匹配的app/ps1小鼠及野生型同窝小鼠给予相同体积的生理盐水腹腔注射。此外,设置一组没有接受任何干预的9月龄app/ps1小鼠作为治疗实验的基线对照组。第二部分,依达拉奉,33.2mg/kg/日,混入饮用水中给药。3月龄开始依达拉奉口服给药,9月龄为终点,持续6个月;空白对照组(性别年龄匹配的app/ps1小鼠)和野生型对照组(性别年龄匹配同窝小鼠)给予正常饮食。至既定终点,各组小鼠接受行为学检测。治疗实验中每组3只小鼠接受高尔基(golgi)染色。行为学检测。预防实验中实验动物接受多种行为学检测,包括morris水迷宫检测,y迷宫检测,旷场实验检测。治疗实验和口服实验中实验动物行morris水迷宫检测。所有行为学检测采用双盲。elisa检测。冻存脑组织在液氮环境下研磨,依次用tbs,2%sds和70%甲酸溶液萃取。脑组织提取物中aβ40,aβ42,il-6,il-1β,inf-γ,tnf-α、丙二醛(mda)浓度及羟自由基的清除能力根据相应的制造商提供的实验方法进行检测。α-分泌酶、β-分泌酶、超氧化物歧化酶(sod)和谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)的活性应用新鲜脑组织根据相应elisa试剂盒的实验方法进行检测。组化分析。刚果红染色及6e10免疫组化染色选用5个代表性脑组织冠状冰冻切片(间距约~1.3mm)进行。脑组织切片同时行chat,map-2,cd45,gfap,pser396-tau,3-nt和caspase-3免疫染色(1:100或1:200稀释),chat,cd45,gfap,3-nt和pser396-tau,应用dab体系显色,neun、map-2和caspase-3应用alexafluor荧光二抗进行荧光染色。脑组织矢状切片行硫酸素s染色。每根脑血管的caa(脑淀粉样血管病)严重程度根据4分评定方法进行打分。普鲁士蓝染色检测脑组织内微出血。tunel染色检测细胞凋亡。golgi染色根据fdrapidgolgistaintm试剂盒提供的实验方法进行。每种染色图片采集后应用imagej图像处理软件进行图像分析。免疫蛋白印迹。应用免疫蛋白印迹法检测aβ生成和降解相关酶或蛋白分子,tau磷酸化、氧化应激和突触相关标志物在app/ps1小鼠脑内的表达水平。ripa缓冲液提取脑组织中蛋白,sds-page(4–10%或4-10-15-18%丙烯酰胺)跑胶,转膜,孵育相对应的一抗。应用irdye800cw二抗孵育,odyssey荧光扫描仪扫膜。蛋白表达水平应用β-actin或gapdh标化。临床试验受试者的入组和外周血采集。募集2013年7月至2014年7月大坪医院就诊的中重度ad患者共30例。入组后给予神经心理学检测,包括mmse,cdr和adl评分,同时搜集所有患者年龄、性别和教育程度等临床资料。随机分为2组,依达拉奉组和对照组。采集治疗第1天和第8天的空腹外周血,分离血浆进行aβ40和aβ42检测。上述临床实验在我校伦理委员会备案,同时在中国临床实验注册中心注册。所有受试者均签署知情同意书,或经授权的家属签署。统计分析。除另作说明,结果均以mean±s.e.m.表示,两组之间比较采用studentt-test或man-witneyutest,多组之间比较采用one-wayanova或two-wayanova,必要时行趋势检验。p<0.05具有统计学意义。3.结果(1)依达拉奉抑制aβ聚集,拮抗aβ神经毒性。既往实验提示多种天然抗氧化剂如姜黄素(curcumin)和葡萄籽提取多酚(grape-derivedpolyphenolics)能够抑制aβ聚集。基于这些发现,我们推测自由基清除剂依达拉奉,可能具有干扰aβ聚集的作用。应用tht实验,我们发现依达拉奉与aβ单聚体或已成型的aβ纤维共同孵育时,能够剂量依赖性地减少aβ聚合诱发的tht荧光强度。免疫蛋白印迹法进一步提示依达拉奉抑制aβ纤维的形成,表现为加样孔底依达拉奉组的aβ纤维强度显著高于对照组。同时,依达拉奉剂量依赖性地增加可溶性aβ种类。此外,透射电镜实验进一步证实依达拉奉具有抑制aβ纤维的形成和解聚aβ纤维的作用。形态学观察发现,依达拉奉共孵育下的aβ纤维转变为扭曲、短小纤维,或无定型的聚合体。为进一步探索aβ42与依达拉奉的作用位点,我们应用tht法行aβ42片段竞争实验。我们发现,在7个aβ42片段中,只有aa13-18aβ42片段能够增加依达拉奉抑制的tht荧光强度,提示依达拉奉可能与aβ42aa13-18结合。同时,实验证明所有aβ42片段不能干扰aβ42纤维形成,其自身也不具备形成纤维的能力。假定的依达拉奉结合片段aa13-18恰恰位于aβ42的beta折叠形成区域。基于上述发现,我们进一步检测依达拉奉是否具备拮抗aβ神经毒性的能力。以人体神经母细胞瘤sh-sy5y细胞为体外实验模型,我们发现,依达拉奉剂量依赖性地拮抗aβ引起的神经元死亡和轴突塌陷。此外,应用新生小鼠原代皮层神经元作为另一种细胞模型,我们进一步证实依达拉能够拮抗aβ引起的神经元死亡、轴突塌陷和ros产物增加。这些结果提示,依达拉奉具有抑制aβ聚集和中和aβ神经毒性的作用。(2)依达拉奉改善app/ps1小鼠的行为缺陷。morris水迷宫,预防实验中和治疗实验中依达拉奉组app/sp1小鼠行为学表现均优于各自的app/ps1对照组,表现为依达拉奉组逃逸时间和逃逸距离明显减少,穿越隐蔽平台的次数和在目标区域的探索时间显著增加。预防实验中,9月龄app/ps1小鼠的智能损害能够被依达拉奉扭转,其逃逸时间接近于同龄野生型小鼠。至12月龄,依达拉奉组app/ps1小鼠逃逸时间多于同龄野生型小鼠,但接近未干预的9月龄app/ps1小鼠。各组小鼠之间游泳速度无明显差异。预防实验中依达拉奉组app/ps1小鼠y迷宫表现也优于对照组。在自发性交替实验中,依达拉奉组小鼠表现出更高的alternation百分比,更多的总进臂次数。在新臂探索实验中,依达拉奉组app/ps1小鼠具有更多的新臂探索次数和探索时间。我们同时发现,预防实验中依达拉奉组app/sp1小鼠的后腿直立探索次数和探索距离显著高于对照组。修饰次数两组之间无差异。(3)依达拉奉降低app/ps1小鼠脑内aβ水平。为了探讨依达拉奉对app/ps1小鼠脑内aβ的影响,我们首先行刚果红染色和6e10免疫组化染色,分别用来检测致密性aβ斑块和总aβ斑块水平。与对照组比较,我们发现依达拉奉能够显著减轻app/ps1小鼠脑内的致密性aβ斑块和总aβ斑块的数量。基于aβ在脑血管壁内沉淀的多少,我们将caa的严重程度分为4级,0级(无caa)-3级(严重caa)。我们发现,无论是预防给药,抑或治疗给药,依达拉奉均能显著降低caa严重程度。同时,我们发现,治疗实验中依达拉奉组微出血的数量明显低于对照组。elisa实验进一步证实,无论预防给药,抑或治疗给药,依达拉奉显著降低app/ps1小鼠脑组织tbs、sds、甲酸提取物中总aβ、aβ40和aβ42的含量。这些实验结果提示依达拉奉能够减轻app/ps1小鼠脑实质和脑血管内aβ的沉积。(4)依达拉奉抑制aβ产生。依达拉奉不影响总app表达,但是依达拉奉能够降低app/ps1小鼠脑内app的β剪切,同时增加α剪切,表现为依达拉奉组app/ps1小鼠脑内β剪切产物ctfβ、sappβ及aβ含量降低,而α剪切产物ctfα和sappα含量增高。与体内实验结果一致的是,依达拉奉剂量依赖性地上调sh-sy5y-app695细胞内ctfα和sappα的表达,同时下调ctfβ和sappβ的表达。进一步研究发现,依达拉奉能够显著地上调adam-10的表达和α分泌酶的活性,降低bace1酶(β-分泌酶)的表达及活性,而对ps1无影响。与上述结果一致的是,依达拉奉剂量依赖性地下调sh-sy5y-app695细胞内bace1酶的表达。依达拉奉对aβ降解酶,脑啡肽酶(neprilysin,nep)及胰岛素降解酶(insulin-degradingenzyme,ide),和aβ血脑屏障转运分子,如低密度脂蛋白(lrp)和晚期糖基化终末产物受体(rage)的表达无影响。(5)依达拉奉减少神经元死亡和神经突变性,减轻神经炎症。预防实验或治疗实验中,与对照组比较,依达拉奉组app/ps1小鼠海马neun,map-2和chat阳性面积显著增高,而caspase-3和tunel阳性染色水平显著降低,星形胶质细胞活化和小胶质细胞活化水平亦显著降低。此外,治疗实验中依达拉奉组tnf-α,ifn-γ,il-1β和il-6等促炎症细胞因子水平显著低于对照组。更为重要的是,我们发现依达拉奉组突触相关蛋白的表达和海马区域树突棘的数量显著高于对照组。(6)依达拉奉降低app/ps1小鼠的tau磷酸化水平。预防实验和治疗实验中依达拉奉组的皮层和海马pser396-tau阳性面积明显低于对照组。免疫蛋白印迹进一步提示,与对照组比较,依达拉奉组多个位点的tau磷酸化水平(丝氨酸396,262,199和苏氨酸231)显著降低。此外,依达拉奉给药后,gsk3β的ser9磷酸化水平显著升高。与动物实验一致的是,edaravone剂量依赖性地抑制aβ诱导的pser396-tau上调,增加pser9-gsk3β与总gsk3β的比率。上述结果提示依达拉奉通过抑制app/ps1小鼠脑内aβ水平减轻tau蛋白过度磷酸化。(7)依达拉奉降低app/ps1小鼠脑内氧化应激水平。我们通过生化和免疫组化方法探讨依达拉奉对app/ps1小鼠脑内氧化应激水平的影响。与对照组比较,依达拉奉治疗组超氧化物歧化酶(sod)和谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)和脑组织清除羟自由基的活性均显著升高,脂质过氧化产物丙二醛(mda),4-羟基壬烯醛(4-hne)和蛋白过氧化产物2,4-二硝基苯肼(dnph)和3-硝基酪氨酸(3-nt)显著下降。此外,我们发现,依达拉奉组3-nt的减少以海马区域为著。(8)口服依达拉奉对app/ps1小鼠的治疗作用。基于药物动力学实验结果-口服依达拉奉的生物利用度为静脉给药的38%,口服实验中,我们给予APP/PS1小鼠依达拉奉33.2mg/kg/日。Morris水迷宫测试提示口服依达拉奉亦能改善APP/SP1小鼠的行为缺陷,表现为逃逸时间缩短,穿越平台数次增加。同时,依达拉奉口服给药能显著减轻海马和皮层的Aβ斑块数量及APP/PS1小鼠脑内的总Aβ水平。(9)依达拉奉治疗增加AD患者血液Aβ水平。前文体内及体外实验证实依达拉能够影响Aβ的聚集状态和代谢,我们进一步探讨依达拉奉是否能够影响人体Aβ水平。在AD患者中,依达拉奉治疗8日后,血浆Aβ水平显著提高,提示依达拉奉能够影响体内Aβ代谢,可能机制在于依达拉奉进入脑内,促进Aβ沉积解聚,形成可溶性Aβ而流向外周血液。4.结论依达拉奉通过抑制Aβ聚集和拮抗氧化应激的两重作用,发挥预防和治疗AD的作用,包括抑制脑内Aβ沉积、促进Aβ清除,减少Aβ生成,减轻氧化应激和神经炎症水平,抑制tau蛋白过度磷酸化,最终改善APP/PS1小鼠的认知功能。初步临床试验也表明依达拉奉能影响AD患者体内Aβ代谢。这些结果提示,依达拉奉能够干预AD多个关键病理机制,有望成为一个AD防治新药。