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研究目的:本研究通过应用自噬诱导剂雷帕霉素(RAPA)联合顺铂(DDP)检测其对舌鳞状细胞癌p160细胞凋亡、增殖、迁移能力的影响,结合自噬相关蛋白MAP1LC3、PTEN、m TOR在人舌癌中表达及其与舌癌临床病理特征间的相关性,探讨自噬相关m TOR信号通路与凋亡的可能相关机制,旨在为自噬相关蛋白及通路作为舌癌治疗的新靶点提供理论依据。研究方法:1、应用CCK-8法检测不同浓度RAPA、DDP作用于舌癌p160细胞不同时间后的细胞生长抑制率,并计算DDP半数抑制浓度(IC50),筛选RAPA药物浓度,检测RAPA、DDP、RAPA+DDP分别作用于p160细胞24 h后细胞生长抑制情况;2、应用Western-blot法检测不同浓度RAPA作用于p160细胞后其自噬相关蛋白LC3的表达情况;3、应用流式细胞仪检测RAPA、DDP、RAPA+DDP分别作用于p160细胞24 h后细胞的凋亡情况;4、应用划痕实验检测RAPA、DDP、RAPA+DDP分别作用于p160细胞6 h、18 h、24 h后细胞的迁移距离;5、随机选取2011年1月-2015年1月期间于天津市口腔医院行手术切除的人舌鳞状细胞癌石蜡标本46例、癌旁组织13例、癌前病变组织13例,转移淋巴结标本39例,应用免疫组织化学染色法检测MAP1LC3、PTEN、m TOR蛋白的表达;并分析其表达水平与各临床病理指标间的相关性及其相互之间的关系。研究结果:1、RAPA单纯作用于p160细胞时,24 h及48 h时:细胞生长表现为先增加后抑制;72 h时:细胞生长受到抑制,且随浓度增加而增加。RAPA作用于p160细胞后,低浓度时起保护作用,高浓度时起抑制作用,而且,低浓度作用时间足够长时,也可引起自噬性死亡;2、DDP单纯作用于p160细胞时,细胞生长受到抑制,且随时间及浓度的增加而增加,具有时间及药物浓度依赖性;3、采用重复测量方差分析及LSD-t两两比较,CCK-8法检测对照组、RAPA组、DDP组、RAPA+DDP组四组不同加药实验组细胞活力,对照组及RAPA组细胞活力无差别,DDP组及DDP+RAPA组细胞出现生长抑制,且DDP+RAPA组(OD值=0.83±0.13)细胞活力明显小于DDP组(OD值=1.14±0.16,P=0.008);4、流式细胞仪检测四组细胞凋亡情况,结果显示对照组及RAPA组细胞基本无凋亡,DDP组存在明显凋亡(22.3%),RAPA+DDP联合用药组细胞凋亡则更加明显,由22.3%增加至47.0%,且主要表现为早期凋亡细胞的增加;5、采取划痕实验比较对照组、RAPA组、DDP组、DDP+RAPA四组之间细胞在6 h、18 h、24 h时与0 h迁移距离差值的大小,结果显示:6 h后对照组的划痕距离为0.56±0.07 cm,RAPA组划痕距离为0.54±0.09 cm,DDP组划痕距离为0.18±0.14 cm,DDP+RAPA组划痕距离为0.09±0.07 cm;18 h后对照组的划痕距离为0.86±0.18 cm,RAPA组划痕距离为0.84±0.11 cm,DDP组划痕距离为0.52±0.23cm,DDP+RAPA组划痕距离为0.42±0.05 cm;24 h后对照组的划痕距离为1.29±0.21 cm,RAPA组划痕距离为1.16±0.04 cm,DDP组划痕距离为0.64±0.26 cm,DDP+RAPA组划痕距离为0.54±0.03 cm。采用方差分析及多个样本均数两两比较,DDP组及RAPA+DDP组迁移距离与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05),而三个时间段中,只有24 h时,DDP组与RAPA+DDP组的迁移距离差值相比,差异有统计学意义(P<0.05);6、免疫组化结果显示:PTEN、LC3、m TOR主要表达于细胞浆,46例舌癌病灶标本中,PTEN在舌癌组织中的表达率(34.78%)低于癌前病变及癌旁组织中的阳性表达(69.23%,76.92%,P<0.05);MAP1LC3在舌癌组织中的阳性表达率(28.26%)低于癌前病变及癌旁组织中的阳性表达(61.53%,69.23%,P<0.05);m TOR在舌癌组织中的表达率(65.22%)高于癌前病变及癌旁组织中的阳性表达(23.08%,31.77%,P<0.05)。卡方检验显示:PTEN、MAP1LC3、m TOR在年龄、性别、吸烟、饮酒、组织学类型中的表达差异均无统计学意义(P(29)0.05);MAP1LC3、PTEN及m TOR的表达与舌癌的有无淋巴结转移、临床分期有关(P<0.05),随着淋巴结转移、临床分期越晚,PTEN及LC3的阳性表达率降低,m TOR的阳性表达率越高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1、雷帕霉素可诱导细胞发生自噬,一定程度的自噬具有细胞保护作用,而过度自噬则可引起细胞凋亡,且这种凋亡可能为自噬性死亡;2、雷帕霉素可能作为化疗增敏剂应用于临床,仍需动物实验及临床试验进一步研究;3、PTEN、LC3、m TOR蛋白表达水平与患者的临床分期、淋巴结转移有关,PTEN、LC3蛋白低表达、m TOR蛋白高表达时提示可能预后不良;4、m TOR信号通路参与细胞自噬过程,且与细胞凋亡相关,可以作为舌癌治疗新的研究方向及靶点。