庆大霉素(Gentamicin)是重要的氨基糖苷类抗生素,早在二十世纪六十年代就从棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)中被分离并鉴定。由于其在治疗革兰氏阴性菌引起的重度感染中展示出良好的临床疗效被沿用至今,而且近年来庆大霉素被不断发现具有新的药效活性,被认为对于临床治疗上难以攻克的HIV病毒、结核杆菌等危及人类生命的疾病等具有潜在应用价值。本研究旨在利用分子遗传学的手段证明gmr A作为庆大霉素产生菌中必须的抗性基因,并在此基础上建立抗性测试快速筛选系统,进一步探索产素菌合成基因簇上与抗性相关的其他基因,为探索氨基糖苷类抗生素的多重耐药性的协同机制奠定基础。首先,根据全基因簇序列,结合生物信息学分析,筛选出可能参与庆大霉素生物合成途径中发挥抗性功能的候选基因gmr A。然后采用同框敲除的方法对抗性候选基因gmr A进行同框缺失,但实验结果显示其双交换突变株难以筛选,暗示gmr A很有可能是一个必须基因,发挥有关抗性的作用。因此,通过构建gmr A加倍的突变菌株,再对该菌株中的原位gmr A进行同框缺失,筛选到了染色体加倍菌株中的gmr A原位敲除突变株,从而证明了gmr A是一个不可缺失的抗性基因。其次,为了达到快速有效的筛选其它潜在的抗性基因的目的,本研究成功建立了一套基于大肠杆菌的庆大霉素抗性基因快速筛选系统,并进一步测试了抗性候选基因gmr B、gen P、gen H、gen I、gen V。揭示了16s r RNA甲基转移酶Gmr B辅助Gmr A共同影响庆大霉素与核糖体RNA靶位点的亲和性;磷酸化修饰酶Gen P通过对庆大霉素C组分中2-DOS结构上第三个糖环的二位羟基进行磷酸化钝化了庆大霉素的活性;负责胞外运输的Gen H与Gen V通过降低菌体胞内庆大霉素C组分的浓度而表现辅助抗性。本研究揭示出庆大霉素产生菌中所包含的多种抗性基因及其功能,为探索氨基糖苷类抗生素的耐药问题及其相互作用的机制奠定了基础,从而使我们能够更好的利用以及改造庆大霉素等氨基糖苷类化合物。