目的:探究无荚膜流感嗜血杆菌DNA(NTHI-DNA)在NTHI诱导免疫应答中的作用,并对其应答机制进行研究。背景:无荚膜流感嗜血杆菌(NTHI)是一种常见的革兰阴性菌,正常情况下,作为条件致病菌定植于上呼吸道,但当免疫力低下时可以移行至下呼吸道,诱发感染性疾病。一直以来,NTHI作为胞外菌被人们所熟知;但现有研究证实,NTHI也可以内化进入细胞。内化的细菌可以躲避高浓度的抗生素,这是中耳炎和慢性阻塞性肺疾病(COPD)加重的重要原因。在肺炎链球菌、李斯特菌、结核分枝杆菌等多个感染模型中已证实细菌DNA可以被胞内DNA识别受体所识别进而诱导一系列信号通路开放,其中干扰素刺激基因(STING)介导的I型干扰素(I-IFN)产生是DNA免疫中最典型的信号通路。目前尚未有NTHI-DNA可以诱导机体免疫应答的报道。因此,本研究我们将对NTHI-DNA通过STING信号通路诱导I-IFN产生的机制进行探究。主要研究方法1.采用抗生素保护实验(APA)检测NTHI感染后,IFN-β和CXCL10的表达,了解内化NTHI诱导免疫应答的能力;提取NTHI-DNA分别刺激上皮细胞和巨噬细胞,并检测I-IFN和CXCL10的表达,初步证实NTHI-DNA作为免疫刺激物可诱导机体免疫应答。2.初步检测NTHI感染后细胞中几种常见DNA识别受体的表达;干扰RNA(si RNA)特异性敲低MEF细胞中c GAS的表达,检测c GAS对内化NTHI及NTHI-DNA诱导I-IFN及CXCL10的影响。3.分别比较NTHI-DNA刺激下,STING野生细胞(MEFWT)与STING缺陷细胞(MEFSTING-/-)以及HEK293T细胞中空载组与过表达STING组诱导IFN-β及CXCL10的差异,证实STING在NTHI-DNA介导免疫应答中的作用。比较NTHI-DNA刺激后,HEK293T细胞中空载组、过表达TBK1组、过表达TBK1(ΔULD)组诱导IFN-β及CXCL10的差异,明确TBK1在NTHI-DNA诱导免疫应答中扮演的角色。NTHI-DNA刺激下,采用免疫荧光技术检测细胞核内p-IRF3的表达;比较HEK293T细胞中空载组与过表达IRF3组诱导IFN-β及CXCL10的差异,了解IRF3对NTHI-DNA诱导免疫答的影响。主要实验结果1.内化NTHI及NTHI-DNA均可诱导I-IFN及CXCL10表达上调,且在RAW264.7细胞中观察到,NTHI-DNA诱导I-IFN及CXCL10具有时间依赖性。2.DNA受体检测结果显示:NTHI感染后,BEAS-2B细胞中c GAS和IFI16的表达上调;并且c GAS的表达与内化进入胞内的NTHI数量成正比。si RNA特异性敲低c GAS后,会抑制内化NTHI及NTHI-DNA诱导I-IFN的表达。3.相比于STING野生细胞(MEFWT),STING缺陷细胞(MEFSTING-/-)诱导I-IFN及CXCL10的能力被显著抑制。与空载组相比较,HEK293T过表达STING可以促进IFN-β的表达;过表TBK1后IFN-β和CXCL10的表达也显著上调,然而过表达TBK1(ΔULD)对IFN-β和CXCL10并无显著影响。免疫荧光结果显示,NTHI-DNA可以诱导细胞核内的p-IRF3表达上调;过表达IRF3能够上调NTHI-DNA介导的IFN-β。总结与讨论胞内NTHI-DNA通过STING信号通路诱导上皮细胞和巨噬细胞产生I-IFN和CXCL10;结合内化NTHI也可诱导IFN-β和CXCL10上调的结果,我们认为NTHI-DNA通过STING信号通路介导的免疫应答可能参与NTHI感染的发生发展。该研究有助于加深我们对NTHI与宿主免疫相互作用的认识,为寻找针对NTHI预防和治疗新方法提供理论基础。