论文部分内容阅读
转录因子是真核表达调控中非常重要的一类反式作用因子,在细胞的增殖、分化与动物的生长发育中起着关键的作用。随着动物基因组计划的进行,许多影响猪经济性状的重要基因逐渐被发现,取得了广阔的应用前景。近些年来,国内外已经研究鉴定了许多与猪生长发育有关的重要转录因子,为猪的育种奠定了基础。但仍有许多重要的转录因子在猪上还未研究。本研究利用生物信息学与分子生物学技术相结合的方法,克隆和定位了四个转录因子基因,取得了如下成果:1.利用生物信息学结合RT-PCR克隆获得了猪TEF-1、RTEF-1、KLF6和KLF7四个转录因子基因完整编码区的cDNA序列。2.利用RH克隆板对TEF-1、RTEF-1、KLF6和KLF7四个基因分别进行了染色体精细定位,结果表明TEF-1基因定位于SSC2p14—2p17,与SW1857连锁(LOD值为9.77);RTEF-1基因定位于SSC5q24-5q25,与SW1987连锁(LOD值为6.29);KLF6基因定位在SSC10q14-q16,与SW1041连锁(LOD值为6.39);KLF7则定位在SSC15q24,与SWR1002连锁(LOD值为11.3)。3.采用半定量RT-PCR技术检测基因的表达水平,结果表明猪TEF-1基因在所检测的90天胚胎组织中广泛表达,其中在肝和肺中表达量较高,在成年组织中也是广泛表达,肌肉中表达量最高,不同时期肌肉组织中表达量呈上升趋势。RTEF-1基因在检测的90天胚胎组织中广泛表达,其中肝、肺和肌肉中表达量较高,而且在肌肉组织中存在两种转录本;两种转录本在成年肌肉组织中特异表达,且表达量均较高。对KLF6和KLF7基因组织表达谱检测,结果表明KLF6和KLF7都是广泛表达的转录因子基因。4.采用PCR—RFLP方法检测了TEF-1基因5’非翻译区(UTR)中距离起始密码子154bp的一个碱基突变位点,并在本室与通城县畜牧局共同组建的试验群体中检测了TEF-1基因5’非翻译区的突变位点的多态性,结果表明,该基因5’非翻译区的突变位点与猪出生至上市日增重显著相关(P<0.05)。发现了已克隆KLF6基因cDNA序列的两个错译突变C459G和C778T,分别导致脯氨酸/精氨酸和丙氨酸/缬氨酸的改变,在本室与通城县畜牧局共同组建的试验群体中检测并没有发现其与生长、肉质等性状有显著的关系。5.构建猪RTEF-1基因重组原核表达载体pET28a-RTEF-1,利用SDS-PAGE检测出该重组原核表达载体成功表达出了猪RTEF-1蛋白,并用亲和层析技术纯化出了该蛋白。