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和其他食物过敏相比,花生过敏症状严重,致死率高,是人类安全与健康的巨大威胁,也是主要的研究对象。花生中已被确认的过敏原蛋白有17种,Ara h 2因其强烈的致敏性和极高的过敏患者血清IgE识别率而被认为是花生中最主要的过敏原蛋白之一。烘焙作为一种常见的加工方式,会改变花生蛋白的高级结构,造成过敏原表位的破坏、暴露或生成,从而对花生蛋白的致敏性产生影响。本文以鲜花生和烘焙花生为研究对象,首先自制Ara h 2免疫亲和柱,从中分离纯化Ara h 2蛋白,并通过免疫印迹法结合质谱法鉴定亲和纯化获得的分离产物组分,然后对烘焙前后Ara h 2单体的结构及性质进行表征,通过圆二色光谱法、紫外吸收光谱法分析烘焙加工对Ara h 2高级结构的影响,通过不同的评估方法（竞争ELISA法和细胞模型）,比较烘焙前后Ara h 2的潜在致敏性。本文的研究方法、主要结果及结论如下:1.用于免疫日本大耳兔的Ara h 2通过离子交换层析法从新鲜花生中分离得到,经过12周的免疫后获得兔抗花生全蛋白血清及兔抗Ara h 2血清,并通过ELISA法检测其效价。用Protein G亲和柱分离抗Ara h 2的兔Ig G,以此作为配基制备自制免疫亲和柱,分别从鲜花生及烘焙花生中分离纯化Ara h 2。结果显示:阴离子柱纯化的Ara h 2纯度在90%以上,制备得到的兔抗花生全蛋白血清效价达1:60 000,兔抗Ara h 2血清效价达1:100 000,以其中的兔抗Ara h 2Ig G制备了免疫亲和柱,能够从鲜花生分离获得Ara h 2,纯度达88.9%。亲和柱也能从烘焙花生中分离获得Ara h 2及其衍生物,得到的分离产物中包括Ara h2、Ara h 6及一些大分子量的蛋白,其中Ara h 2单体含量仅占整个泳道灰度的13.4%。2.通过兔血清免疫印迹和质谱法对鲜花生及烘焙花生纯化分离产物进行鉴定,结合Ara h 2空间结构模型初步分析烘焙加工对Ara h 2结构的影响。结果表明,经亲和纯化后,从鲜花生中得到了Ara h 2（含少量的Ara h 6）,而烘焙花生的亲和分离产物组分较复杂:除Ara h 2、Ara h 6单体外,在分子量70 k Da附近有多条条带,在分子量43 k Da附近也有一明显条带,其中包含Ara h 2、Ara h 6与Ara h 1、Ara h 3的交联产物,这证实了烘焙加工会引起蛋白之间的交联反应。质谱分析显示在鲜花生分离产物中检测到Ara h 2的20条肽段,而烘焙后检测到的Ara h 2肽段数目减少,只有11条,其中差异肽段主要集中在第二个螺旋末端、第五个螺旋前端及无规卷曲区域,表明烘焙加工会对Ara h 2的高级结构产生影响,改变酶切位点的暴露情况,从而造成检测肽段的差异。3.利用圆二色光谱法和紫外光谱法研究烘焙加工对花生蛋白Ara h 2单体高级结构的影响,结果表明:通过阴离子柱纯化得到的鲜花生中Ara h 2（Ion-Exchange Chromatography Purified Native Ara h 2,IPN Ara h 2）与通过自制免疫亲和柱纯化得到的鲜花生中Ara h 2（Afficity Chromatography Purified Native Ara h 2,APN Ara h 2）在结构上无明显差异,IPN Ara h 2和APN Ara h 2二级结构中α-螺旋的含量分别为27.1%和25.7%,无规则卷曲含量分别为27.9%和29.1%,紫外吸收峰相差不大,说明纯化方法对Ara h 2的结构并无影响。而烘焙加工会使Ara h 2的α-螺旋含量减少,无规卷曲含量增多,亲和纯化分离得到的烘焙花生中Ara h 2（Afficity Chromatography Purified Baked Ara h 2,APB Ara h2）的α-螺旋含量为21.6%,无规卷曲含量为34.3%,紫外吸收峰明显升高,说明高温烘焙下的蛋白趋于无序,整体结构变得更加舒展。4.烘焙加工导致花生蛋白Ara h 2的结构发生变化,进而影响其致敏性。利用花生过敏患者血清,采用免疫印迹法表征了鲜花生及烘焙花生亲和分离产物的IgE结合情况,通过竞争ELISA法测定了烘焙前后Ara h 2单体的IgE结合能力,以人外周血嗜碱性粒细胞KU812脱颗粒作用释放的细胞因子水平评估烘焙前后Ara h 2单体的致敏性变化。结果表明:免疫印迹中鲜花生及烘焙花生的亲和分离产物的主要显色部分在Ara h 2、Ara h 6条带的位置,烘焙花生中的过敏原交联产物显色较弱,这显示交联后的过敏原蛋白,其IgE结合能力较弱。ELISA结果显示不同纯化方法得到的鲜花生Ara h 2的IC50值分别为0.156μg/m L和0.158μg/m L,烘焙后Ara h 2的IC50值为0.098μg/m L,说明不同纯化方法得到的鲜花生Ara h 2潜在致敏性相当,烘焙加工会使Ara h 2的IgE结合能力增强。细胞实验的结果表明,烘焙加工后Ara h 2的β-HEX释放率和TNF-α的释放量升高,而组胺释放量减少,说明烘焙加工后Ara h 2单体刺激人嗜碱性粒细胞脱颗粒程度升高,但募集粒细胞促炎症因子的能力降低。