泛素蛋白水解酶途径通过特异性的泛素化修饰与靶蛋白的精细结合,对蛋白质翻译后修饰和降解起了关键作用,参与了各种生物学过程,包括细胞周期调控,信号传导,翻译后修饰,细胞代谢、分化、增殖和肿瘤发生等。泛素蛋白水解酶途径由泛素、泛素活化酶(E1)、泛素结合酶(E2)、泛素-蛋白连接酶(E3)、26S蛋白酶体和泛素解离酶等组成。E3连接酶是其中最为关键的因子,它可以对不同的底物进行特异性的识别,呈现出蛋白降解的高度选择性,最终使泛素化的蛋白质被26S蛋白酶体所降解。Smurf2隶属于C2-WW-HECT亚类的E3连接酶,通过调控细胞内外信号传导,诱导细胞凋亡,参与细胞衰老,从而影响疾病的发生、发展。本论文研究了Smurf2及其下游底物分子在肝癌、肝硬化和正常肝组织中的表达情况和分子间相互作用,分析了Smurf2对人类肝星状细胞功能的影响,初步揭示了Smurf2在肝病中的作用机制。同时我们进一步使用免疫共沉淀联合LC-MS/MS方法,初步筛选和鉴定了Smurf2通路中的底物分子,并对Smurf2泛素蛋白水解酶途径相关的肝癌关键因子进行探索,为肝病发生机制和治疗奠定基础。第一部分Smurf2及其底物的表达、相互作用和泛素化分析我们收集了肝癌、癌旁和肝脏良性病灶组织,按病理,分为肝癌、肝硬化和正常肝组织三组。分别采用Real-time PCR和Western Blot方法,检测Smurf2及其已知底物(Smad7、TβRI、SnoN)mRNA和蛋白质水平的表达情况。结果发现,和正常肝组织相比,Smurf2在肝癌和肝硬化组织中表达下调,该差异具有统计学意义;Smad7和TβRI表达上调,其差异也具有统计学意义(P＜0.01);SnoN在三组中的表达没有明显差异。Smurf2和Smad7、TβRI在肝癌和肝硬化组织中的表达存在相反的关系,为此,我们使用免疫共沉淀分别进行三个分子的相互作用研究和分析。以抗Smurf2抗体为一抗,在肝组织裂解液中行免疫共沉淀,其产物用抗Smad7和抗TβRI的抗体作WB检测。结果发现Smurf2和Smad7和TβRI具有两两相互作用,形成异质复合物。用抗泛素抗体为一抗,在肝组织裂解液中行免疫沉淀后,其产物分别用抗Smad7和TβRI抗体作WB检测,结果发现和泛素结合的分子包含Smad7和TβRI。为了证实何种底物被泛素化,我们使用抗Smurf2抗体为一抗,行免疫沉淀,再用抗Smad7或TβRI抗体行二次免疫沉淀,其产物用抗泛素抗体行WB检测,结果显示Smad7和TβRI均被泛素化。第二部分TGFβ诱导Smurf2表达与肝纤维化的关系研究我们检测到Smurf2在肝硬化组织中的低表达,为了阐明Smurf2在肝纤维化中的作用,我们通过培养活化的人肝星状细胞LX-2,加用TGFβ1刺激后,检测Smurf2、Smad7、TβRI蛋白表达水平的变化,用ELISA检测细胞培养上清液中胶原含量情况。结果发现TGFβ1通过上调Smad7和Smurf2的表达,减少胶原的分泌;过表达Smad7和Smurf2明显抑制胶原分泌。我们进一步研究发现Smurf2的抑制胶原作用是通过泛素依赖的蛋白水解酶途径,降解TβRI,减少TβRI表达,抑制TGFβ信号传导而完成的;蛋白酶抑制剂MG132可以阻止该作用。因此,我们认为,在肝硬化组织中Smurf2的低表达,可能是TGFβ诱导Smurf2负反馈表达机制受损所致;Smurf2低表达导致了对TβRI降解减少,对TGFβ信号通路失去抑制作用,导致了肝纤维化的进展。第三部分Smurf2底物分子的初步筛选以及与泛素化途径相关的肝癌关键因子的探索上述结果显示了Smurf2在肝脏中的重要作用,但是Smurf2通路的信号分子未被人们全部发现和深入研究。我们利用Smurf2和其信号分子特异性结合的特性,在人类肝组织裂解液中,用Smurf2抗体进行免疫共沉淀,行SDS-PAGE电泳后,联合LC-MS/MS鉴定,初步发现了十余个Smurf2相关底物分子;其中8个在肝癌中存在,在正常肝组织中未被检出;另有7个分子在正常肝组织存在,肝癌中未检出。同时,抗Smurf2抗体免疫沉淀后产物直接行LC-MS/MS分析发现,在正常肝组织中存在24个与Smurf2相联系蛋白分子,肝癌组织中存在42个与Smurf2相关蛋白分子。其中包含文献已经报道的和肝癌发生发展相关的蛋白分子,如HSPβ1,也包含未知功能蛋白或者未被发现和肝癌相关的蛋白分子。由此可见,用免疫沉淀联合LC-MS/MS方法,更易于发现有意义的肝癌相关因子,缩小筛检范围。综上所述,我们检测了Smurf2和其底物分子Smad7和TβRI在肝癌、肝硬化组织中的表达,发现Smurf2和其底物分子的表达存在相反关系;Smurf2和Smad7、TβRI作用,形成异质复合物;Smurf2以Smad7为调节子,通过泛素依赖的蛋白水解酶途径降解TβRI,从而抑制TGFβ信号传导;在肝硬化中,TGFβ诱导Smurf2产生的负反馈机制受损,Smurf2低表达导致了对TβRI降解减少,失去了对TGFβ信号通路的抑制作用,导致了肝纤维化的进展;通过免疫沉淀联合高敏感度的LC-MS/MS分析,分离并鉴定了与Smurf2相结合信号分子,为今后Smurf2底物分子的筛选以及Smurf2泛素蛋白水解酶通路相关的肝癌关键因子的探索提供了一个新的方法。