纤维素是地球上含量最为丰富的碳水化合物之一,也是最廉价的可再生资源。里氏木霉(Trichoderma reesei)是一种能够高效降解纤维素的丝状真菌,能够在诱导碳源存在的条件下迅速做出响应并产生大量的纤维素酶。目前里氏木霉已广泛地应用于纤维素酶的工业生产,但生产中的高成本仍是制约生物能源以及许多生物基大宗产品生产的一个瓶颈问题。木霉属真菌会产生诸多的次级代谢物质,而黄色色素只产生于里氏木霉。里氏木霉的黄色色素是由一个含有polyketide synthase(PKS)编码基因在内的基因簇合成,并且其产生的时间及水平均受到严格的调控。有研究表明里氏木霉所产的黄色色素可能属于聚酮化合物Sorbicillinoids家族,但黄色色素在里氏木霉生理生长过程以及纤维素酶的表达调控中的具体作用仍不清楚,对该问题的研究将会为通过菌株改造以进一步提升纤维素酶产量及简化其提取流程奠定理论基础。为了研究里氏木霉所产黄色色素在其生长发育及纤维素酶表达调控过程的作用,本论文对位于该黄色色素合成基因簇内的两个转录因子的编码基因及一个PKS编码基因进行敲除或过表达,同时获得了黄色色素高产及缺陷的突变株,并分析了这些突变株的营养生长、产孢能力、细胞壁完整性、抗逆性以及纤维素酶表达情况等。取得的主要成果如下:一、分别构建转录因子Ypr1过表达菌株OEypr1和Ypr2敲除菌株Δypr2,分析发现两个突变株均高产黄色色素,并且突变株的生理生长及纤维素酶的表达均受到严重影响。以里氏木霉QM9414-△pyr4为出发菌株构建了 Ypr1过表达和Ypr2敲除两株黄色色素高产菌株,碳源利用实验表明这两个突变株对葡萄糖的利用能力显著下降;显微镜观察结果显示它们菌丝体中心膨大,菌丝分支变粗变短;孢子计数分析发现突变株产生分生孢子的数量明显减少;进一步的压力响应分析实验发现细胞壁的完整性和抗逆性均严重受损。突变株以不定形纤维素为诱导碳源时,胞外纤维素酶的表达基本消失,且这种降低是由纤维素酶基因在转录水平的下调引起。二、分别构建转录因子Ypr1敲除菌株Δypr1和Ypr2过表达菌株OEypr2,分析发现两个突变株均不产黄色色素,并且突变株的生理生长及纤维素酶的表达均有所增强。通过在里氏木霉野生型中敲除Ypr1及过表达Ypr2得到了Δypr1及OEypr2两株黄色色素缺陷突变株。与野生型QM9414相比,黄色色素缺陷菌株Δypr1及OEypr2在液体葡萄糖培养基中的生物量增加;孢子计数分析发现突变株分生孢子产生的数量要明显高于野生型;压力响应分析实验发现突变株的细胞壁完整性及抗逆性均有所增强;突变株以不定形纤维素为诱导碳源时,胞外纤维素酶酶活提高了约15%,但纤维素酶基因的相对转录水平并无明显提升。通过与上述黄色色素高产菌株进行对比,发现黄色色素缺陷菌株在生长发育、压力响应及纤维素酶表达方面均表现出与之相反的表型。三、在里氏木霉野生型及高产黄色色素菌株中敲除黄色色素合酶基因sor1,得到的两个突变株均不产黄色色素,且在生理生长及纤维素酶表达等方面表现出与上述通过改造转录因子获得的黄色色素缺陷菌株(Δypr1和OEypr2)一致的表型。通过在野生型及高产黄色色素菌株OEypr1中敲除黄色色素合酶编码基因sor1得到Δsor1及OEypr1-Δsor1菌株,这两株突变株均无黄色色素产生,并且它们对液体葡萄糖的利用能力、生孢能力、细胞壁完整性、抗逆性以及纤维素酶的表达能力均强于野生型,这与黄色色素缺陷的△ypr1及OEypr2菌株的表型相似。由此可知黄色色素而非其转录调控因子ypr1或ypr2是造成色素突变株的生长表型及产酶表型变化的主要因素。HPLC-MS检测发现黄色色素的成分主要是Sorbicillinoids家族的二聚物及单体物。综上所述,本论文的研究首次阐述了里氏木霉产生的黄色色素在其生长发育、压力响应及纤维素酶表达中的重要作用。相对于野生型菌株,不产黄色色素的突变菌株表现出生物量增加、抗逆性增强、纤维素酶产量提升以及无需色素处理的优良性状,表明其具有较大的工业应用潜力,能够进一步为以里氏木霉为宿主的蛋白生产提高效率并有效降低成本。