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研究背景：消化道肿瘤是多发的恶性肿瘤，其发病率和年轻化呈逐年增长趋势，死亡率一直处于较高水平。肿瘤的发生是一个复杂的过程并且受到多重因素的影响，包括个体遗传因素、环境因素、物理化学因素、分子生物学因素等等。在机体细胞中，维持正常功能的前提是基因有序的转录调控，而染色质的结构改变是真核细胞基因表达调控的一个重要机制，如其转录调控发生紊乱，细胞生长就会失去控制导致癌变。研究证明组蛋白乙酰化(histone acetylase，HAT)与去乙酰化(histone deacetylase,HDAC)可以改变染色质结构，染色质上的组蛋白不仅仅是结构的组成部分，它们在保存染色质的动态平衡方面起着十分重要的作用，当核小体的组蛋白乙酰化状态发生改变时，其特定的转录因子活性随之也发生变化，从而影响相关基因的转录与表达。也正是这种动态平衡控制着多细胞生物在各个发育阶段的表达谱。而组蛋白乙酰化状态是由组蛋白乙酰基转移酶(HATs)和组蛋白去乙酰化酶(HDACs)协调控制。它们参与了DNA的损伤修复、染色体异位、转录调控、基因沉默、细胞分化与增殖、细胞周期和细胞凋亡等多个过程。在肿瘤细胞中，越来越多的证据表明组蛋白乙酰化(HAT)与去乙酰化(HDAC)表观遗传学改变是其发生与发展相关的重要因素。而HATs与HDACs活性发生了改变，导致组蛋白的异常修饰，影响肿瘤的发生和发展的关键点。由于在多种肿瘤中存在HDACs的结构或表达的异常以及组蛋白乙酰化水平的异常，因此可以以此为靶点进行肿瘤的治疗。常规的治疗方法因缺乏靶标的选择性往往产生较为严重的毒副反应,极大地制约了临床效果的发挥。而组蛋白去乙酰化酶是一个与肿瘤的发生、发展和转移相关且对肿瘤细胞生长调控具有普遍生物学意义的蛋白，可能可以成为一个广谱低毒的抗肿瘤药物的作用靶标。第一部分抑制HDAC1表达对消化道细胞生长及放射敏感性影响的探讨研究目的：应用慢病毒介导的RNA干扰技术，沉默消化道肿瘤细胞株中的HDAC1表达并观察对其生物学特性的影响，进一步探索其中的分子机制，为控制肿瘤的发生、发展提供新的靶点和干预思路。方法及结果：1.成功获得慢病毒SiHDAC1并感染EC109细胞，采用有限稀释法将细胞种植于2. Realtime PCR检测mRNA水平和Western blot检测细胞总蛋白水平的改变，证实慢病毒LV-SiHDAC1成功干扰了EC109细胞中HDAC1的表达。3.流式细胞术分析发现在HDAC1受到抑制的EC109细胞周期分布中，S期减少，G1期增加。且细胞的增殖活性明显降低，差异显著。4.对慢病毒干扰的EC109细胞，采用x线进行照射，发现磷酸化H2AX明显升高，提示干扰HDAC1基因表达后DNA损伤增强。采用Annexin-V//PI染色方法检测，发现两株细胞辐射后HDAC1干扰组凋亡增加，明显高于正常对照细胞，提示干扰HDAC1基因表达能有效增强辐射效应。第二部分MCM-2作为HDAC抑制剂TSA对结肠癌细胞作用靶点的探讨研究目的:应用HDAC抑制剂TSA阻滞细胞周期的进程，探讨其与微小染色体维持蛋白(MCM家族)的相应变化，为以其作为靶点进行抗肿瘤治疗提供新的思路及方法。方法及结果：1.经Western blot检测TSA处理HCT116细胞后组蛋白乙酰化H3表达，发现随加药后时间延长或TSA浓度增高而升高，并且通过CCK-8和Annexin-5检测出现生长抑制和凋亡的情况，但是lovo组明显低于HCT116组。同时经western blot发现caspase-3随TSA浓度增高而表达增强，BCL-2则相反，与DNA修复相关的PARP表达也逐步增强。2.流式细胞仪检测发现TSA处理后出现细胞周期分布中，G1期延长，S期减短。3.采用RT2Profiler PCR分析，发现与细胞周期相关的84个基因中有34个基因表达发生了改变，其中7个高表达，27个低表达，其中BIRC5(survivin), CCNB1(cyclinB1), CCND1(cyclinD1)和MCM家族表达下调最明显；p16、p21、p27三个细胞周期相关蛋白明显增强。另外发现以另一种HDAC抑制剂4-PBA处理HCT116和lovo后，P21表达同样被上调。4.采用定量PCR和western blot检测，发现MCM-2随着药物浓度的增加其表达逐渐降低，随TSA处理时间的延长，表达不断降低。5.分三个靶点通过siRNA技术沉默MCM-2表达并成功转染HCT116细胞，发现第三组(Si-3)干扰效果最为明显。经流式细胞仪检测发现其细胞周期中，S期明显缩短(34.4%±3.6%vs25.0%±2.9%)，G1期稍有延长(51.8%vs56.7%)。此外，发现细胞生长随剂量升高而明显降低。6.通过siRNA技术沉默HCT116细胞中MCM-2的表达，与对照组相比凋亡明显增加。western blot结果显示当MCM-2沉默后凋亡明显增加并且与剂量浓度相关，同时发现与DNA修复相关的PARP表达明显增强，抗凋亡基因Bcl-2明显降低。7.通过western blot检测，发现JNK的磷酸化表达程度随TSA作用时间延长或浓度增高而增高，同时也证明MAPK信号通路同时被激活。通过SP600125(JNK抑制剂)恢复MCM-2的表达.发现其蛋白层面的表达也随之改变,MCM-2表达的下降程度明显被抑制，提示HDAC抑制剂TSA明显影响了JNK信号通路的改变。