脓毒症(sepsis)是指由病原微生物感染所引起的全身性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),是严重感染、重度创伤和烧伤、休克、大手术后等临床危重患者的严重并发症之一,其进一步发展可导致脓毒症休克(septic shock)、急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)和多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)等。它是机体对微生物产物的过度反应,是一种放大的失控性免疫反应。脓毒症及其引发的脓毒症休克是危重病医学面临的棘手问题,一直是导致临床危重患者死亡的主要原因之一。尽管目前对脓毒症的发病机制的研究已取得一些成果,但在临床治疗上仍未获得满意的答复。研究者们有应用内毒素抗体和肿瘤坏死因子等炎症因子的拮抗剂以及基础支持等辅助疗法进行了大量的动物实验和临床实验,但均未收到满意的效果,至今脓毒症的死亡率仍居高不下。这都提示我们对脓毒症特别是脓毒症休克的认识还有待深入。越来越多的证据显示生物体重要器官如肺脏在脓毒症发生发展中扮演着至关重要的角色,但是其病理生理过程的分子机制至今未明。脓毒症动物模型是研究脓毒症发病机制和临床防治所必须的实验平台,同时也是脓毒症研究的一个难点。目前脓毒症动物模型的构建方法多种多样,包括盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture,CLP)制作腹腔感染的脓毒症模型、升结肠支架置入腹膜炎制作腹腔感染的脓毒症模型、细菌或内毒素攻击模型等。其中CLP感染模型是一种由多种微生物导致的脓毒症模型,该法是通过外科手术方式诱导急性化脓性腹膜炎脓毒症后持续感染刺激,大量细菌及毒素迅速吸收入血并播散至全身,机体各脏器炎症反应剧烈,肺、肠、肝组织炎症因子及内毒素水平显著升高,组织严重损伤,最后形成MODS,较大程度上模拟了人类脓毒症时脂多糖(lipopolvsaccharide,LPS)持续攻击这一病理过程,具备良好的人体适合性。因此,越来越受到脓毒症研究界的青睐。在早期的研究中,科学家们发现Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)介导的信号转导途径是脓毒症早期炎症激活及促炎反应的重要路径。近年来随着对脓毒症发病机制的深入研究,越来越多的证据显示高迁移率蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)作为潜在的晚期炎症介质参与了脓毒症的发病过程,是内毒素致死效应的晚期重要炎性介质。尽管目前科学界对于HMGB1参与晚期炎症反应的作用机制已经有了一些新认识,如有研究报道,HMGB1能够通过与Toll样受体4/2、晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products,RAGE)以及其他一些细胞表面受体结合激活下游信号通路从而参与晚期炎症反应,但由其介导的晚期脓毒症的细胞信号通路模式目前还有许多未知与困惑,由HMGB1及其受体介导的下游近端信号事件的研究仍然有待深入。RAGE作为HMGB1的传统信号转导途径中的受体之一,属于免疫球蛋白超家族成员,广泛分布于多种细胞表面,在肺脏组织中高表达,能够与多种配体结合,其与HMGB1的亲和力却远远高于其它配体。在脓毒症的发病过程中,早期动物实验证实,严重烫伤和腹腔感染后6～24h肝、肺及小肠组织HMGB1基因表达显著增多,且一直持续至伤后72h,局部组织HMGB1诱生与LPS介导器官功能损害关系密切。同时,有报道表明,RAGE的激活在CLP诱导的腹腔感染致组织损伤中起着非常重要的作用,通过将小鼠RAGE基因敲除以及阻止HMGB1与RAGE受体二者的相互作用都能较大程度减轻组织损伤,提高动物生存率以达到保护机体的作用。因此,对晚期脓毒症发展过程中由HMGB1与RAGE介导的下游信号通路的研究有着十分重要的临床意义。脓毒症时机体肺脏组织是炎症反应最早也是最容易受到损伤的器官之一,CLP脓毒症模型后肺脏髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、肺泡灌洗液中总蛋白以及炎症因子等快速升高,而且病理变化显著,这些提示肺脏组织的损伤参与了脓毒症及脓毒症休克的病理生理过程。脓毒症休克小鼠RAGE缺失后肺脏究竟会发生哪些功能事件?其分子机制如何?目前知之甚微。对这些问题的解答,将有益于我们从分子水平上深入认识脓毒症的发病机制。众所周知,蛋白质是生命活动的最终执行者,我们要研究脓毒症休克肺脏组织的功能变化其实就是研究肺脏组织蛋白质的变化。而对脓毒症休克过程中发生变化蛋白质的解析,差异蛋白质组学研究可以为我们提供一个很好的支持。差异蛋白质组学能通过比较样本间蛋白质表达水平的变化,寻找差异分子,进而解决各式的生物学问题。差异蛋白质组学研究技术的不断革新使得从整体上研究肺脏蛋白质组在生理、病理过程中的变化成为可能。目前已涌现出许多新颖的差异蛋白质组分析方法,其中荧光差异凝胶电泳(difference gel electrophoresis,DIGE)技术由于继承了二维凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)的高分辨率,同时又具备高通量、高重现性和高动态范围等优势,目前已经成为定量蛋白质组学研究领域最常用的手段之一。DIGE是基于2-DE的基础上,通过对不同的蛋白样品用不同的荧光染料进行标记,在同一块双向凝胶中可同时分离多至三种不同的蛋白样品,并且每块胶上又引用了内标,内标的引用进一步增加实验的可信度,避免了系统误差对实验结果的影响,确保了结果的真实可靠。本实验首先通过摸索并构建了小鼠脓毒症休克模型,然后结合本实验室的荧光差异双向电泳分离技术-基质辅助激光解吸离子化-飞行时间/飞行时间质谱仪鉴定技术(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight/time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF/TOF)-生物信息学分析技术(bioinformatics)的差异蛋白质组学技术平台,对脓毒症休克小鼠RAGE缺失后的肺脏组织差异蛋白质组图谱进行研究。首先分别选取正常(RAGE+/+)小鼠和RAGE因敲除(RAGE-/-)的C57/BL6小鼠,每组四只小鼠随机分为对照组和实验组,对照组施以假手术(Sham组),实验组施以盲肠结扎穿孔术(CLP组),总共构成N-Sham、N-CLP、KO-Sham和KO-CLP四组,每组小鼠均在术后8h处死,摘取肺脏组织,并提取总蛋白,经DIGE分离后通过DeCyder 2D差异分析软件分析找到差异蛋白点72个,N+CLP/N+Sham表达上调有5个,下调的有22个,KO+CLP/KO+Sham表达上调的有11个,下调的有4个,对比分析后发现受RAGE调控的有25个差异点。对这些差异蛋白点利用MALDI-TOF/TOF质谱仪进行蛋白质鉴定,共鉴定出61种蛋白质,其中受RAGE调控的蛋白有25种。利用亚细胞定位软件WOLF PSORT对这25种差异蛋白进行亚细胞定位分析。结果表明,结果表明,15个蛋白存在胞浆定位,13个蛋白存在细胞核定位,8个蛋白存在胞浆和细胞核穿梭,9个蛋白存在线粒体定位,6个蛋白有细胞外定位,3个蛋白有胞浆和线粒体穿梭,1个蛋白有线粒体和胞核穿梭,4个骨架蛋白定位,4个有内质网定位。这些结果可以看出,多数差异蛋白存在于胞浆和细胞核中,提示在脓毒症休克过程中动物体肺脏组织功能事件的调控主要是由位于胞浆和胞核中的蛋白来完成。同时在质谱鉴定时,发现有三个差异蛋白点被鉴定为同一种蛋白质Krt7,且变化趋势一致以及表达差异明显,表明该蛋白可能发生了翻译后修饰,结合文献调研,我们将该蛋白作为后续的验证对象。为了验证DIGE结果的可靠性,利用Western blot来验证Krt7的蛋白表达变化情况。实验结果表明,Krt7蛋白表达变化和DIGE结果一致。为了验证该蛋白在mRNA上的表达变化,用实时荧光定量PCR(real-time quantitivePCR,Q-PCR)进行实验。结果显示,N-CLP与N-Sham组相比较,表达发生下调,组间存在显著性差异;而KO-CLP与KO-Sham组相比较,表达基本无差异。与DIGE结果趋势一致。同时构建了 pcDNA3-Krt7-HA真核表达载体,转染NIH3T3细胞,观察外源性Krt7蛋白在细胞内的定位情况。结果显示Krt7融合蛋白在NIH3T3细胞中主要定位于细胞浆中。表明质粒构建成功。通过上述研究,我们可以得出如下4点结论:1.成功实施并构建了小鼠盲肠结扎穿孔术脓毒症模型。2.建立了脓毒症休克正常和RAGE基因敲除的C57/BL6小鼠肺脏组织差异蛋白质组图谱。采用差异软件分析得到72个差异蛋白点,并进行质谱鉴定,结果鉴定出61种差异蛋白质,其中受RAGE调控的蛋白有25种。3.分别从蛋白水平和mRNA水平验证Krt7的表达变化,结果显示与DIGE实验基本一致。4.细胞免疫化学荧光结果显示Krt7融合蛋白在NIH3T3细胞中能有效表达并正确定位,表明重组载体构建成功,为进一步探讨Krt7在脓毒症休克中的生物学功能奠定了实验基础。本实验从“组学”的角度和活体组织水平,基于DIGE分离技术与MALDI TOF/TOF质谱鉴定技术相结合的差异蛋白质组学技术平台构建了脓毒症休克小鼠RAGE缺失后的肺脏差异蛋白质组图谱,并对此过程中与RAGE相关并受其调控的目的差异蛋白质进行了初步分析及功能验证,为深入研究RAGE及其配体介导的相关信号通路在脓毒症及脓毒症休克过程中的作用提供了新的实验数据,同时也为脓毒症及脓毒症休克的病理生理机制及其防治策略提供支持。