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目的:1.基于网络药理学探究苓术菟丝子丸治疗肾性蛋白尿的关键靶点和信号通路。
2.通过体内外实验观察苓术菟丝子丸的主要有效成分——异鼠李素是否对阿霉素诱导的足细胞损伤起保护作用,并验证是否通过JAK/STAT/Klf4通路发挥作用。
方法:1.运用中药系统药理学技术平台(TCMSP)获取苓术菟丝子丸组方药物的有效成分和靶点,OMIM、GeneCards数据库获取肾性蛋白尿的靶点,再通过Cytoscap软件构建“活性成分—靶点—疾病”网络。使用String数据库绘制蛋白互作图,DAVID数据库进行GO及KEGG富集分析。最终筛选出苓术菟丝子丸的主要有效成分、治疗肾性蛋白尿的作用靶点及预测通路。
2.采用小鼠足细胞MPC-5与不同浓度的异鼠李素共培养,通过CCK8检测细胞活性,评价不同浓度的异鼠李素对于阿霉素诱导足细胞损伤的作用。
3.建立小鼠阿霉素肾病模型后随机分组:正常组、模型组、异鼠李素组、药物毒性监测组。正常组和模型组予以生理盐水灌胃,异鼠李素组和药物毒性监测组予以异鼠李素10mg/kg灌胃,共干预8周。观察各组小鼠生存状况,每2周检测24小时尿蛋白定量。干预结束后心脏采血测定Alb、Scr、BUN、CHOL;ELISA法检测TNF-α、MCP-1水平;HE、MASSON、PAS染色观察肾脏组织的病理改变;实时荧光定量PCR测定Klf4、Nephrin的mRNA表达;Western Blot法检测肾脏pJAK2、pSTAT3、pNF-κB、MCP-1、TGF-β、Nephrin、WT1、F-actin及Klf4的蛋白表达水平。
结果:1.基于网络药理学在苓术菟丝子丸组方中筛选出具有改善肾性蛋白尿作用的活性成分有138个,其潜在的生物作用靶点为NF-κB信号通路、JAK/STAT信号通路、TNF信号通路等共58条显著富集的通路以及氧化还原、核受体活性等93个生物过程。
2.异鼠李素可改善阿霉素诱导的小鼠足细胞MPC-5的损伤。
3.异鼠李素能减少阿霉素肾病小鼠24小时尿蛋白定量,改善肾脏的病理组织结构,升高血浆Alb,降低MCP-1、TNF-α的浓度,增加Klf4、Nephrin的mRNA表达,下调pJAK、pSTAT3、pNF-κB、MCP-1、TGF-β的蛋白水平,升高Nephrin、WT1、F-actin、Klf4的表达。
结论:1.苓术菟丝子丸组方中可有效改善肾性蛋白尿的主要有效成分是异鼠李素。
2.异鼠李素可减轻阿霉素诱导的足细胞损伤,改善阿霉素肾病小鼠的肾脏结构与功能,其作用机制可能与调节JAK/STAT/Klf4通路,抑制炎症有关。
2.通过体内外实验观察苓术菟丝子丸的主要有效成分——异鼠李素是否对阿霉素诱导的足细胞损伤起保护作用,并验证是否通过JAK/STAT/Klf4通路发挥作用。
方法:1.运用中药系统药理学技术平台(TCMSP)获取苓术菟丝子丸组方药物的有效成分和靶点,OMIM、GeneCards数据库获取肾性蛋白尿的靶点,再通过Cytoscap软件构建“活性成分—靶点—疾病”网络。使用String数据库绘制蛋白互作图,DAVID数据库进行GO及KEGG富集分析。最终筛选出苓术菟丝子丸的主要有效成分、治疗肾性蛋白尿的作用靶点及预测通路。
2.采用小鼠足细胞MPC-5与不同浓度的异鼠李素共培养,通过CCK8检测细胞活性,评价不同浓度的异鼠李素对于阿霉素诱导足细胞损伤的作用。
3.建立小鼠阿霉素肾病模型后随机分组:正常组、模型组、异鼠李素组、药物毒性监测组。正常组和模型组予以生理盐水灌胃,异鼠李素组和药物毒性监测组予以异鼠李素10mg/kg灌胃,共干预8周。观察各组小鼠生存状况,每2周检测24小时尿蛋白定量。干预结束后心脏采血测定Alb、Scr、BUN、CHOL;ELISA法检测TNF-α、MCP-1水平;HE、MASSON、PAS染色观察肾脏组织的病理改变;实时荧光定量PCR测定Klf4、Nephrin的mRNA表达;Western Blot法检测肾脏pJAK2、pSTAT3、pNF-κB、MCP-1、TGF-β、Nephrin、WT1、F-actin及Klf4的蛋白表达水平。
结果:1.基于网络药理学在苓术菟丝子丸组方中筛选出具有改善肾性蛋白尿作用的活性成分有138个,其潜在的生物作用靶点为NF-κB信号通路、JAK/STAT信号通路、TNF信号通路等共58条显著富集的通路以及氧化还原、核受体活性等93个生物过程。
2.异鼠李素可改善阿霉素诱导的小鼠足细胞MPC-5的损伤。
3.异鼠李素能减少阿霉素肾病小鼠24小时尿蛋白定量,改善肾脏的病理组织结构,升高血浆Alb,降低MCP-1、TNF-α的浓度,增加Klf4、Nephrin的mRNA表达,下调pJAK、pSTAT3、pNF-κB、MCP-1、TGF-β的蛋白水平,升高Nephrin、WT1、F-actin、Klf4的表达。
结论:1.苓术菟丝子丸组方中可有效改善肾性蛋白尿的主要有效成分是异鼠李素。
2.异鼠李素可减轻阿霉素诱导的足细胞损伤,改善阿霉素肾病小鼠的肾脏结构与功能,其作用机制可能与调节JAK/STAT/Klf4通路,抑制炎症有关。