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背景:糖尿病伤口愈合是一个重要的临床挑战，因为轻微的皮肤伤口可能会导致慢性的，未愈合的溃疡，最终导致感染，坏疽，甚至截肢。随着干细胞治疗研究的发展，骨髓间充质干细胞(BMSCs)在治疗糖尿病皮肤溃疡的研究中表现出巨大的潜能。另有研究表明，富含血小板血浆(PRP)含有一系列生长因子，为创面的愈合和修复提供良好微环境，从而促进组织创伤愈合和再生。因此，探讨两者联用于糖尿病伤口愈合显得尤为重要，能够为将来的临床应用提供实验依据。
第一部分大鼠骨髓间充质干细胞系的建立和鉴定
目的:体外分离BMSCs，并对分离的细胞进行生物学鉴定，从而建立稳定的BMSCs培养扩增体系。
方法:
1.采用贴壁培养法分离幼年SD大鼠骨髓中的BMSCs，然后进行纯化和扩增细胞。
2.通过对细胞形态学观察、流式细胞仪检测BMSCs特异的表面抗原和细胞周期的测定等，从而确立稳定的BMSCs培养扩增体系。
结果:
1.原代细胞在3-5天内呈相对静止状态，随后生长迅速。第二代细胞形态均一，呈扁平状、梭形。
2.在分离的BMSCs中，CD90和CD29阳性率＞90％，而CD45和CD11b/C阳性率＜2％。
3.85.33％的第二代BMSCs细胞处于G0/G1期，而处S期和G2期的细胞分别为4.76％和9.91％。
结论:分离得到的细胞形态均一，且大部分细胞处于静止期，细胞增殖速度较缓慢，更重要的是能够特异表达BMSCs相关的标记分子。即表明已成功分离到大鼠的BMSCs，为后续的实验研究打下坚实的基础，从而保证了实验数据的重复性和可靠性。
第二部分富血小板血浆制备及对骨髓间充质干细胞的作用
目的:制备PRP并考察其对BMSCs的生物学影响，评估PRP的生物学作用。
方法:
1.收集健康志愿者静脉血，采用二次离心法制备PRP。
2.分别用含有0，1％，2.5％，5％的PRP无血清培养基培养BMSCs，通过MTT法和检测细胞周期，考察PRP对细胞的增殖影响。
结果:MTT结果显示，1％、2.5％和5％PRP对细胞的增殖都有促进作用，且随时间的延长呈剂量相关性。细胞周期结果显示，5％PRP组S期细胞百分比明显高于空白组，表明PRP可促进细胞DNA复制。
结论:PRP可促进BMScs增殖，使得两者联用于创面愈合实验成为可能，因此为下一步动物创面愈合实验打下坚实的基础。
第三部分骨髓间充质干细胞联合富血小板血浆对糖尿病大鼠皮肤创面愈合的作用
目的:比较单独使用BMSCs和PRP及两者联合使用治疗糖尿病大鼠皮肤创面的疗效，并初步探讨BMSCs和PRP用于组织创伤的可行性和安全性。
方法:
1.SD大鼠单次腹腔注射链脉佐菌素(STZ)，剂量为60mg/kg。对照组注射等量的柠檬酸钠缓冲液。观察造模组大鼠三多一少症状。采取尾静脉血样测定血糖水平，血糖水平＞300 mg/d(16.7 mmol/L)视为糖尿病大鼠，继续饲养4周，备用。
2.取48只糖尿病大鼠，随机分成BMSCs联合PRP治疗组、BMSCs治疗组、PRP治疗组和对照组四组。在每只大鼠的背部左、右两侧制作出2×2 cm的创面。
3.术后每天观察四组创面愈合情况，用数码照相机记录，测定创面面积，计算愈合率。
4.收集不同时间点的皮肤样本，进行HE和Masson染色，考察组织愈合情况和胶原纤维合成情况。
5.收集不同时间点的皮肤样本，进行免疫组化染色，观察皮肤组织中PCNA、PECAM-1、TGF-β1、CD68阳性细胞的表达数。Western blot检测PCNA和CD68的表达情况。
结果:
1.成功建立糖尿病创伤模型，糖尿病SD大鼠均表现出三多一少糖尿病症状，血糖水平＞300 mg/d(16.7 mmol/L)。
2.在术后3，7，10，14，17和21天，比较各组大鼠创面愈合率，各实验组与对照组相比，均能促进大鼠创面愈合，但BMSCs联合PRP治疗组创面愈合最快。且在术后的第21天，BMSCs联合PRP治疗组愈合率达到96.1％，视为完全愈合。
3.在术后第14天，BMSCs和PRP治疗组可观察到皮脂腺等皮肤附属器官，表明皮肤逐渐再生和成熟;且BMSCs联和PRP治疗组的胶原蛋白表达明显高于其它组，且胶原纤维束排列整齐。
4.BMSCs联合PRP治疗组在各个相应时间点上，皮肤组织中的PECAM-1、PCNA和TGF-β1表达均高于其他组。在术后第7天，各实验组的CD68的表达明显高于对照组，而在第14天，其表达明显低于对照组。
结论:单独使用BMSCs或PRP及联合使用均能促进糖尿病大鼠皮肤创伤的愈合，但两者联用效果最佳，其分子分子可能是通过提高胶原蛋白合成，刺激新生血管生成，促进细胞的增殖，调节炎症反应，诱导TGF-β1的表达而发挥促愈合的作用。因此，本研究为将来BMSCs和PRP联合使用于糖尿病患者伤口愈合提供了实验依据。