研究背景:积雪草,为多年生匍匐草本,又叫马蹄草或铜钱草。分布于我国华东、华南、中南及西南地区海拔2000m以下的沃阴湿处。在我国民间,积雪草多以全草入药,并常作单味药使用,其外用内服治病已有两千多年的应用历史。在《神农本草经》、《中国药典》、《中华本草》等中药典籍中均有记载:列为中品,其性寒,味苦、辛,具有清热利湿、解毒消肿之功效。主要用于治疗疝气腹痛、湿热黄疸、目赤咽痛、疔痈肿毒、跌打损伤等病症。现代临床上常用于治疗皮肤病、梅毒、肝炎、胃溃疡、精神疲劳、癫痫、腹泻、发热、抗病毒和哮喘等。结肠癌(Colorectal Carcinoma,CRC)是消化系统中常见的恶性肿瘤之一,随着人类生活方式、膳食结构的改变及寿命的延长,CRC的发病率及死亡率不断上升。近年来随着医疗水平的不断提高,手术、化放疗等治疗手段的不断完善,在为患者带来希望的同时,也带来了昂贵的治疗费用和极大的药物毒副作用。因此,寻找高效、低毒的药物仍是目前CRC治疗中迫切需要解决的问题。随着中医药现代研究的蓬勃发展,中药有效部位或成分应用于肿瘤治疗发挥了重要作用,加强对结肠癌确有疗效中药资源开发、有效部位作用机制研究一直是结肠癌防治研究的重点之一。细胞凋亡是生命活动过程中一项重要的生理或病理现象。PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信号通路是与细胞增殖和凋亡最密切相关的通路之一,因其处于细胞生长调节的中心环节而倍受关注。近年来的研究发现在肺癌、肾癌、消化系统肿瘤、泌尿系统肿瘤及妇科肿瘤均存在PI3K/Akt/mTOR信号通路的过度激活。该信号传导通路的活化对细胞增殖、分化、转移、侵袭及血管生成的各个环节有着重要作用。中草药具有抗肿瘤作用已经得到确认,目前报道的抗肿瘤作用机制主要集中在诱导肿瘤细胞凋亡、抑制细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化和调节细胞内信号转导等方面。研究目的:本课题是在参考《本草纲目》、《中华本草》、《中药大辞典》等著作,检阅并研究相关文献研究,结合课题组前期研究基础,计划选择结肠癌细胞株SW480/HCT116为研究对象,以积雪草酸为干预药物,通过体外实验研究确定积雪草酸对细胞株SW480/HCT116具有增殖活性、抑制迁移能力、诱导细胞凋亡等作用,在此基础上进一步探讨积雪草酸诱导细胞凋亡的相关信号通路,明确作用靶点,阐述作用机制,为研究积雪草酸抗结肠癌作用奠定实验基础,为结肠癌治疗提供新的备选药物和新的药物干预靶点,推进中药有效部位在临床中的应用,为中西医结合医学和转化医学的发展提供基础数据。研究方法:1积雪草酸抑制结肠癌细胞的增殖活性1.1细胞培养及药物制备人类结肠癌SW480/HCT116细胞由南方医科大学肿瘤研究所保存。SW480/HCT116细胞用含10%新生牛血清的1640培养基,于5%CO2,95%湿度,37℃培养箱中培养并传代后培养24h,取对数生长期细胞分组进行药物处理。积雪草酸药物溶液的制备:称取积雪草素10mg,加入DMSO100μl,使其完全溶解后,用10ml完全培养基稀释至浓度为1mg/ml的积雪草酸母液,并用0.22μm滤器过滤除菌,保存于-20℃冰箱备用。对照组加入含DMSO 0.25%培养液,并进行后续实验。1.2 MTT法检测细胞活性取对数生长期的SW480、HCT116细胞,消化、计数,以2×105/ml密度接种于96孔培养板中,设置不同浓度的药物干预细胞,以含0.1%DMSO的培养液作对照。药物分别作用细胞24、48、72h后,加MTT溶液,置于培养箱中避光继续孵育4h,弃去培养液,加入DMSO,摇床震荡混匀10min,酶标仪在490nm处测定OD值,计算抑制率,计算公式:抑制率(%)=(1-给药组OD值/对照组OD值)× 100%。1.3细胞形态观察倒置显微镜观察积雪草酸作用结肠癌细胞形态学的变化。分别将对数生长期的细胞接种于六孔板中,分为对照组和药物处理组,观察不同浓度的药物处理后细胞的形态变化,倒置显微镜观察并拍照。1.4平板克隆形成实验平板克隆形成实验检测细胞的增殖能力。取对数生长期细胞消化计数,以200个/孔接种于六孔板中,待细胞贴壁后,选取的药物浓度培养细胞,当肉眼观察到培养皿中有可见克隆时,终止培养,甲醇固定细胞后,苏木素染色,计克隆个数,计算克隆形成率。克隆形成率=克隆数/细胞接种数×100%。2积雪草酸抑制结肠癌细胞的迁移能力2.1 Transwell迁移实验Transwell细胞迁移实验来检测细胞的迁移侵袭能力。制备含BSA的培养基的细胞悬液,调整密度为5×105/ml。取100μl加入上室,24孔板下室加入600μl含20%BSA的培养基常规培养24h待细胞穿膜贴壁终止培养。取出小室,PBS洗2遍,甲醇固定30min,苏木素染色20min,取出基底膜用二甲苯和树脂封片,显微镜下取6-8个视野观察细胞并计数。2.2 Western Blot实验检测细胞EMT相关蛋白变化收集各处理组细胞,裂解并提取蛋白,进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后,将分离的蛋白转移至PVDF膜上,封闭1h后,加一抗体于4℃摇床孵育过夜,加入相应的HRP标记的二抗室温孵育1h,发光成像仪记录结果。3积雪草酸诱导结肠癌细胞凋亡及机制研究3.1 Hoechst 33342荧光染色检测细胞凋亡分别设立对照组和药物处理组,待药物干预24h后,用PBS洗2遍,分别加入浓度为5μg/ml的Hoechst 33342染液避光孵育5min,再用PBS洗2遍,用350nm激发波长和460nm发射波长的荧光显微镜观察细胞并拍照。3.2流式细胞仪检测细胞凋亡率Annexin/PI双标法检测细胞凋亡率。消化并收集细胞,用预冷PBS洗1-2遍,加入300μl的Binding Buffer重悬细胞,加入AnnexinV-FITC避光室温孵育15-30min,上机前5min加入5μl的PI染色,上机检测。3.3流式细胞仪检测细胞周期PI法检测细胞周期。将细胞消化成单个,收集并用PBS洗2次,加入预冷的70%乙醇到细胞沉淀中,于4℃固定过夜,加入含50μg/ml溴化乙锭PI的PBS500μl 重悬,100μg/ml 的 RNaseA,4℃避光孵育 30min,上机检测。3.4 Westem blot 检测 PI3K、AKT、mTOR、p70S6K 等相关蛋白的表达收集各处理组细胞,裂解并提取蛋白,进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后,将分离的蛋白转移至PVDF膜上,封闭1h后,加一抗体于4℃摇床孵育过夜,加入相应的HRP标记的二抗室温孵育1h,发光成像仪记录结果。统计学分析所有数据及统计图采用SPSS 20.0软件进行统计学分析及Microsoft Excel统计软件获得,t检验用于两个独立组的比较,单因素方差分析来确定不同群体之间的统计学意义,每个实验至少重复3次以上,P<0.05为有统计学意义。结果1.积雪草酸抑制结肠癌细胞的增殖活性。积雪草酸对SW480和HCT116细胞活性均有显著的抑制作用。与空白对照组相比,不同浓度的药物分别作用于SW480和HCT116细胞,细胞活力明显被抑制:随着药物浓度的增加和作用时间的延长,细胞的抑制率也逐渐升高。细胞经药物处理,与空白对照组相比,药物处理组细胞形态发生明显变化,细胞由长梭形变为近似椭圆形,48h药物处理组细胞出现死亡现象。表明积雪草酸改变了结肠癌细胞的形态。积雪草酸抑制SW480和HCT116细胞的增殖和克隆。与空白组相比,药物处理组中细胞克隆数量明显减少,单个克隆面积缩小,细胞克隆率降低,细胞增殖能力降低。证明积雪草酸降低了结肠癌单细胞的增殖和克隆形成能力。2.积雪草酸抑制结肠癌细胞的迁移能力为了证明积雪草酸对结肠癌细胞SW480和HCT116的迁移侵袭能力,我们进行了 transwell迁移实验。与对照组相比,SW480药物组穿膜的细胞数量明显减少,细胞侵袭能力显著降低,HCT116细胞空白对照组的穿膜数量明显少于SW480的对照组,说明不同细胞株的侵袭迁移能力是不同的。实验结果表明积雪草酸能抑制结肠癌细胞的迁移能力。检测结果发现,两组细胞的药物组N-cadherin,vimentin蛋白表达量显著下调,伴随E-cadherin表达量增加;这一结果与Transwell实验结果是吻合的。证明了积雪草酸能抑制结肠癌细胞的迁移侵袭能力。3.积雪草酸诱导结肠癌细胞发生凋亡Hoechst33342检测结果显示,药物处理组中,由于细胞膜通透性逐渐增加,Hoechst33342染液进入细胞中,细胞中出现亮蓝色荧光,而未经药物处理的对照组细胞膜完整,细胞出现明显拒染,故视野中未见荧光细胞。流式细胞仪采用AnnexinV-FITC/PI分析细胞凋亡率。结果显示,与空白组相比,药物处理组细胞凋亡率升高,且48h处理组明显高于24h。细胞周期检测结果显示,积雪草酸可诱导结肠癌细胞发生S+G2/M期阻滞。结肠癌细胞用积雪草酸分别处理24h及48h后,与对照组相比,G0/G1期细胞数目减少,S+G2/M期细胞数目升高,表明积雪草酸通过阻滞结肠癌细胞S+G2/M期阻滞而诱导细胞凋亡。PI3K/AKT/mTOR信号通路对人类肿瘤细胞的增殖活性具有重要调节作用,凝胶电泳实验发现,经积雪草酸处理后,细胞内PI3K、AKT、mTOR、p70S6K蛋白磷酸化的表达水平下调,同时总蛋白表达也出现下调。说明积雪草酸明显抑制了 PI3K/AKT/mTOR/p70S6K信号通路。为了进一步验证这条通路对细胞的增殖、周期及凋亡中的作用,对细胞程序性死亡因子Pdcd4进行了检测,发现在药物干预后Pdcd4表达上调,我们采用mTOR抑制剂雷帕霉素进一步验证PI3K/AKT/mTOR/p70S6K信号通路是否与积雪草酸对结肠癌细胞功能影响相关。实验结果发现,与积雪草酸组相比,经雷帕霉素预干预后的药物组,进一步降低mTOR、p70S6K蛋白磷酸化水平,并明显增加Pdcd4的表达量。证明了积雪草酸可以通过抑制PI3K/Akt/mTOR/p70S6K通路上调凋亡蛋白Pdcd4,诱导结肠癌细胞SW480/HCT116凋亡,发挥其对结肠癌细胞的抗癌效应。结论:1积雪草酸能抑制结肠癌SW480/HCT116细胞的增殖活性;2积雪草酸能抑制结肠癌SW480/HCT116细胞的迁移能力,并调节与EMT相关蛋白的表达水平;3积雪草酸通过PI3K/Akt/mTOR/p70S6K通路来调节Pdcd4的表达,从而诱导结肠癌SW480/HCT116细胞发生凋亡。