恶性肿瘤是人类死亡的第二大主要因素,而且有逐渐上升的趋势,在有些发达国家,恶性肿瘤甚至以成为危害人类生命安全的头号杀手。而其中,乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一,发病率位于女性恶性肿瘤之首。肿瘤生长的微环境是促进肿瘤进展和活化休眠的癌细胞的潜在致癌因素。许多实体肿瘤中都可以发现炎症细胞浸润,如肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)和巨噬细胞。这些炎症细胞在肿瘤的发展中具有重要的作用:细胞转化、血管生成、转移。的确,在人乳腺癌和结直肠癌中的巨噬细胞浸润与肿瘤的血管生长之间有着密切联系,然而,肿瘤细胞原位产生的细胞因子发挥功能的重要性还不清楚。许多肿瘤的另一种特性是肿瘤细胞的低氧状态和活性氧产物的生成。前人的研究表明,TNF-α,活化的NFκB和ROS均可以在某些细胞引起EMT,但该效应在乳腺癌细胞尚未见报道,而且TNF-α和ROS导致EMT的机制也不清楚。而TNF-α可以活化NFκB以及产生ROS,因此我们认为很有必要研究活化的NFκB和ROS如何导致EMT以及各自在TNF-α诱导EMT中的作用。在发生EMT的过程中,特定区域的上皮细胞基因表达发生彻底改变,其中E-钙粘蛋白(E-cadherin)的下调似乎是关键事件。发生EMT的细胞失去细胞极性和细胞间连接,细胞外基质成分发生降解,细胞变得具有迁移性,可以从上皮上游离下来并迁移到不同的部位。EMT可由Snail从不同途径得到启动。Snail在这个过程中发挥核心作用,协调不同的信号途径。因此,本实验首先观察了TNF-α对乳腺癌细胞系MCF-7迁移能力的影响,在此基础上观察了TNF-α和ROS对重要的转录因子Snail以及其下游分子E-cadherin的表达的影响,探讨了其中的可能机制。尽管MCF-7细胞的侵袭能力较低,我们发现经过TNFα处理后其侵袭能力增强,迁移的细胞数目达到对照组的两倍。与此一致,细胞表达的E-cadherin水平下降,而Vimentin水平升高。在此过程中Snail的表达增加。此外,我们的实验发现NFκB的抑制剂阿司匹林可以阻止TNFα诱导EMT的发生,这表明在TNFα引发肿瘤转移的过程中,NFκB扮演着重要作用。NFκB的抑制剂阿司匹林和mIκBα可以抑制Snail的表达增加以及Snail启动子的活性。相反,我们的实验发现活性氧在TNFα促进细胞转移时扮演着次要作用,因为单纯清除TNFα产生的ROS并不明显抑制EMT的发生。但是,我们的实验发现H2O2自身可以促进EMT,其作用通路与TNFα诱导的EMT不同,其中NFκB仅发挥了次要的作用。简言之,我们的实验涉及了TNFα在刺激细胞发生EMT时所起的重要作用,其中NFκB的作用主要是通过转录上调Snail和E-钙粘蛋白的表达,而在活性氧引起的EMT中,NFκB的作用不十分重要,这为肿瘤转移的预防过程中在不同的情况作用之下选择不同的药物提供了依据。事实也是如此,实验中我们发现Aspirin和NAC可以明显降低TNFα和H2O2处理后迁移的细胞数,即可分别有效的抑制TNFα和H2O2诱发的EMT。基于前面的实验结果,我们可以发现ROS可以诱导Snail的表达,促进EMT的发生。而ROS的形成贯穿于很多生理病理过程。如表皮生长因子(EGF),成纤维细胞生长因子(FGF),转化生长因子β(TGFβ),肝细胞生长因子(HGF),这些生长信号刺激下均有ROS的产生。这些信号分子已经证实可以在不同的细胞背景下诱导Snail基因。所有这些提示ROS参与了多种信号条件下的EMT的发生。但是,前面的实验提示ROS下游分子NFκB在过程中并不扮演决定性作用。这使我们联想到转录后水平的调控。除了转录水平之外,转录后调控,如mRNA转运和翻译,在基因的表达中也有重要的作用。尽管决定mRNA转运的机制仍然不清楚,但大家普遍认为可能涉及到RNA结合蛋白识别特殊的RNA序列。近来大家较为关注一种调节mRNA稳定性,由富含AU元件(AREs)介导的特殊途径,这一般发生于生存期短的mRNAs的3端非翻译区。HuR蛋白可以结合携带AREs的靶mRNA通过其RNA可识别区,从而调节许多靶mRNA的表达,包括编码c-fos,血管内皮生长因子,肿瘤坏死因子α,β-连环蛋白(?-catenin),c-myc,还氧化酶2(cyclooxygenase 2),肌细胞生成素(myogenin),MyoD,多种细胞周期调节蛋白,粒-巨噬细胞集落刺激因子,多种白细胞介素,p21, p27, p53和热休克蛋白70。有趣的是,H2O2能够增强HuR的细胞浆定位,进而增强HuR的功能。对Snail的mRNA的结构进行分析,我们发现Snail分子含有多个HuR结合元件ARE,这促使我们联想到H2O2可能通过增强HuR的细胞浆定位。首先,我们用合成的HuR的siRNA和对照siRNA对MCF-7细胞进行转染,在转染后36小时用Western blotting检测转染效率,发现70%的内源性HuR被敲除。合成的HuR的siRNA和对照siRNA转然后36小时的细胞加入50μM H2O2 ,12小时后提取RNA。在si-HuR组可见Snail mRNA的减少,表明HuR在这个过程中发挥了作用,蛋白水平也发生同样的变化。接着我们观察了在HuR敲除细胞和对照组细胞中Snail的半衰期。在加入H2O2 12小时后加入放线菌素D阻断转录,在si-HuR可出现Snail半衰期的缩短,这说明了HuR可以增加Snail的稳定性。由于HuR一般是通过靶基因的位于3`端非翻译区的ARE元件实现其功能的,我们考虑是否HuR参与了通过假设的AREs调节Snail的3`端非翻译区。因此我们将包括AREs的3’UTR和不含AREs的片断分别克隆至pGL3-control载体,命名为pGL3-control-Snail和pGL3-control-△Snail并转染至si-HuR MCF-7细胞和对照细胞。在没有经过H2O2处理和HuR敲除的MCF-7细胞,相比于pGL3-control-△Snail,pGL3-control-Snail的活性较差,这说明了AREs作为一个元件发挥了稳定性。另外,在HuR没有敲除的MCF-7细胞,只有含有AREs的结构对H2O2处理有反应(H2O2处理后大约有2倍的变化),而在si-HuR MCF-7细胞中,包含AREs的结构也很少对H2O2发生反应。这些结果都显示H2O2通过ARE和HuR的相互作用增加Snail的表达。HuR主要位于细胞核中,在应激条件下可以作为mRNA稳定剂或翻译调节因子进入细胞浆中。为了评估H2O2处理后引起相应的HuR分布的变化,我们用经过H2O2处理和未经过处理的细胞用western blot方法研究亚细胞分布。结果显示HuR主要位于细胞核中,经过H2O2处理后6小时,HuR在细胞质中含量增多,但细胞内总的HuR含量没有明显变化。这些结果显示,H2O2增加Snail的表达至少部分的通过使HuR富集于细胞浆中而参与转录后调控实现的。但是,我们的实验并不否认转录调控的重要性。事实上,Snail极少表达于没有H2O2作用的MCF-7细胞中,因此,我们认为经过H2O2作用的MCF-7细胞中转录调控和转录后调控在下调Snail中都具有重要作用。最后,我们观察了敲除HuR对H2O2诱导的细胞转移的影响。我们观察进行和没有进行HuR敲除的MCF-7细胞在H2O2作用下mRNA水平和蛋白水平上皮细胞钙粘蛋白的表达。在没有进行HuR敲除组,H2O2处理后MCF-7细胞上皮细胞钙粘蛋白的转录减少(约4倍)。在经过HuR敲除地MCF-7细胞中,这种抑制过程仅部分地而不是全部地被消除(经H2O2处理后大约2倍下调),这表明HuR在诱导Snail和后续的抑制上皮细胞钙粘蛋白过程中仅是部分地发挥作用。而且,单独的HuR敲除似乎对于上皮细胞钙粘蛋白的表达没有作用。和mRNA情况相同,上皮细胞钙粘蛋白的蛋白水平表现出了同样的变化。我们还发现H2O2处理后si-HuR细胞的转移能力明显下降。因此,除了抗细胞凋亡能力之外,HuR可能还在细胞转移过程中发挥重要作用。总之,我们的研究发现TNFα和H2O2均可以引起MCF-7细胞发生EMT,使细胞的迁移能力增强。其中NFkB主要介导了TNFα对Snail的调节,而H2O2诱导Snail高表达的过程中HuR扮演着重要的作用。