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冷应激是造成畜禽养殖业的经济效益严重受损的重要原因。课题组前期研究发现,冷暴露会导致肝脏发生损伤,炎症和氧化应激等,但是,冷暴露究竟是通过什么机制引起肝脏损伤的呢?细胞焦亡信号通路在肝脏疾病中显著激活,抑制细胞焦亡信号通路可以缓解疾病,成为预防治疗的途径。那么,冷应激是否能通过激活细胞焦亡信号通路导致肝损伤?本实验通过Western Blot等实验方法,构建小鼠体内和体外的冷应激模型,旨在明确冷暴露激活细胞焦亡信号通路诱导小鼠肝损伤的机制,为防治冷应激带来的损伤提供新的方向。为探求慢性冷暴露对小鼠肝脏损伤的影响,将4周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为2组（对照组:Control;慢性冷暴露组:Cold）,每组6只。将Cold组小鼠每天置于4℃环境中3 h,持续4周。然后进行ELISA,HE染色等实验,结果发现,谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase,ALT）、谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase,AST）和血清中乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）的水平显著升高;并且HE染色结果显示冷暴露小鼠的肝细胞发生炎性细胞浸润等病理变化;Western Blot和q PCR结果分别显示,与Control组相比,热休克蛋白70（Heat Shock Proteins,HSP70）和热休克蛋白90（Heat Shock Proteins,HSP90）的蛋白水平显著升高,说明冷应激模型构建成功;一氧化氮合酶(（Inducible nitric oxide synthase,i NOS）、环氧化酶2（Cyclooxygenase-2,COX-2）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）和高迁移率族蛋白B1（High mobility group box 1 protein,HMGB1）的表达在慢性冷暴露后显著升高,进一步说明了慢性冷暴露能导致炎症因子表达增多;此外,抗氧化蛋白核因子E2相关因子2（Nuclearfactor erythroidderived 2-like 2,Nrf2）及其下游蛋白和基因的表达水平都显著升高相较于Control组,说明慢性冷暴露会导致小鼠肝脏发生氧化应激;并且研究发现凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）与Bcl-2-Associated X的蛋白质（Bcl-2-Associated X,Bax）的比值以及裂解半胱天冬蛋白酶-3（Cleaved-Cysteine-aspartic acid protease 3,Cleaved-Caspase-3）的表达同样显著升高,提示慢性冷暴露会引起小鼠肝脏发生细胞凋亡;NOD样受体蛋白3（Nucleotide-binding domain（NOD）-like receptor（NLR）protein 3,NLRP3）、斑点样蛋白（Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC）、半胱天冬蛋白酶-1（Cysteine-aspartic acid protease 1,Caspase-1）、消皮素D（Gasdermin D,GSDMD）、白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）、白细胞介素-18（Interleukin-18,IL-18）蛋白水平都显著增加,说明慢性冷暴露能诱导细胞焦亡信号通路激活。此外,免疫组化结果显示,冷暴露后NLRP3、GSDMD、Caspase-1和Nrf2的表达增多,进一步说明了冷暴露会诱发小鼠肝脏发生细胞焦亡,且可能与NLRP3以及抗氧化信号通路有关。为探究亚低温处理对小鼠肝细胞AML12的影响,通过光学显微镜观察和MTT试验发现,32℃亚低温（Mild hypothcrmia,MH）条件下不同时间后会使细胞形态发生变化,出现“拉丝”现象,随着冷暴露时间的延长,细胞数量出现时间-依赖性减少,说明亚低温会抑制AML12细胞的生长;Hoechst 33258染色结果显示亚低温处理不同时间后,细胞呈现碎块状致密浓染,暗示亚低温诱导AML12细胞凋亡,并且凋亡蛋白的表达升高进一步证明了这一点;活性氧（Reactive oxygen species,ROS）探针染色试验结果显示亚低温处理不同时间后会引起AML12细胞中ROS水平升高,并且抗氧化蛋白和基因的表达都显著升高,说明亚低温会引起AML12细胞发生氧化应激;HSP70和HSP90的蛋白表达水平升高,说明了小鼠肝细胞亚低温模型成功构建,以便进行后续实验;NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白和基因表达水平显著增加以及炎症因子i NOS、COX-2、TNF-α和HMGB1的表达水平显著升高,都表明了亚低温处理会激活AML12细胞焦亡信号通路,导致肝脏发生炎症损伤。为验证亚低温介导AML12细胞焦亡与抗氧化信号通路之间的关系,分别使用NLRP3抑制剂MCC950和GSDMD抑制剂Necrosulfonamide处理AML12细胞3 h,再放到32℃培养箱中6 h,通过Western Blot实验技术检测焦亡主要蛋白NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β的表达和Nrf2及下游血红素加氧酶-1（Heme oxygenase-1,HO-1）蛋白的表达。结果发现100μM的MCC950和20μM的Necrosulfonamide均能分别有效的抑制亚低温处理引起的AML12细胞中NLRP3和GSDMD激活,以及Caspase-1、IL-1β、Nrf2及下游HO-1蛋白的表达,证明亚低温通过NLRP3/Caspase-1途径激活AML12细胞焦亡和氧化应激信号通路,抑制细胞焦亡信号通路可能会减轻一定的氧化应激损伤,相关的机制还需要进一步实验证明。结论:冷应激介导NLRP3/Caspase-1途径激活AML12细胞焦亡以及氧化应激信号通路诱导小鼠肝组织损伤,因此,调控细胞焦亡信号通路或能成为防治冷应激危害的措施。