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实验目的:肝癌是全世界范围内与癌症相关的最常见的死亡原因之一。肝癌术后复发率及转移率较高,患者的预后较差,而中国是肝癌高发区。上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)在肝癌转移中扮演关键角色,与肝癌侵袭、肝内转移及低存活率密切相关。因此,抑制肝癌细胞发生EMT具有重要意义。华蟾毒它灵(Cinobufotalin)是中药蟾酥的主要成分之一,具有广谱的抗肿瘤活性。本实验的目的是探讨cinobufotalin能否抑制肝癌细胞的EMT和转移,并初步探讨其分子机制。实验方法:本实验采用CCK-8法检测cinobufotalin对肝癌Hep G2和SMMC-7721细胞增殖的影响;用倒置显微镜观察cinobufotalin对细胞形态学的影响;Western blotting实验检测cinobufotalin对两种肝癌细胞EMT相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Snail、Vimentin、Slug、ZEB1)和迁移相关蛋白(β-catenin、DKK1、MMP7)表达的影响;wound healing实验、transwell迁移实验和transwell侵袭实验评价cinobufotalin对肝癌细胞迁移能力和侵袭能力的影响;用荧光定量PCR法和western blotting法检测cinobufotalin对肝癌细胞中β-catenin基因表达和其细胞浆与细胞核中β-catenin蛋白表达量的影响;采用瞬时转染法,构建β-catenin过表达和β-catenin敲减的Hep G2和SMMC-7721细胞模型。基于上述细胞模型,检测β-catenin在cinobufotalin调控Hep G2和SMMC-7721细胞EMT中的作用;建立BALB/c小鼠肺转移瘤模型,在动物水平评价cinobufotalin对肿瘤细胞EMT和转移的影响;通过免疫组化实验,检测小鼠肺肿瘤灶中EMT相关蛋白的表达。实验结果:1、CCK-8实验结果表明,cinobufotalin抑制Hep G2和SMMC-7721细胞的增殖并呈时间依赖性和剂量依赖性。2、用cinobufotalin处理肝癌细胞24 h后,可以发现在给药前后,细胞形态从纺锤形的间充质样形状转变为椭圆形的上皮样形状。3、Western blotting实验结果表明,在肝癌细胞中cinobufotalin能显著影响EMT相关蛋白的表达,即上调上皮标志蛋白E-cadherin的表达,抑制间充质标志蛋白Vimentin、ZEB1、Slug、Snail和N-cadherin的表达。4、Wound healing、transwell迁移和侵袭实验的实验结果显示,cinobufotalin能显著抑制肝癌细胞的迁移能力和侵袭能力。5、实时荧光定量PCR实验和western blotting实验结果表明,cinobufotalin显著降低β-catenin mRNA和蛋白的表达,并抑制β-catenin核蛋白的表达。6、本实验成功构建了β-catenin过表达的肝癌细胞株模型。Western blotting实验结果表明,β-catenin过表达可促进肝癌细胞株的EMT活性,而cinobufotalin能逆转过表达β-catenin对EMT相关蛋白的调控作用。Wound healing、transwell迁移和侵袭实验结果显示,cinobufotalin明显逆转了过表达β-catenin对肝癌细胞迁移和侵袭能力的诱导作用。7、本实验成功构建了β-catenin低表达的肝癌细胞株模型。本部分实验的实验结果显示,在Hep G2和SMMC-7721细胞中,β-catenin低表达显著抑制细胞株的EMT活性及迁移与侵袭能力,且cinobufotalin使该抑制作用增强。8、动物实验结果表明,cinobufotalin显著抑制BALB/c小鼠肿瘤肺转移灶的形成和转移。9、免疫组化实验结果显示,在动物水平,cinobufotalin抑制肿瘤发生EMT。实验结论:Cinobufotalin通过下调β-catenin的表达抑制肝癌细胞发生EMT,进而抑制肝癌细胞的转移和侵袭。