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微栓塞是冠状动脉无复流的主要原因,是急性冠脉综合征(ACS)及经皮冠状动脉介入治疗(PCI)中十分常见且重要的临床病理过程[1],减少冠状动脉微栓塞(CME)的发生以及改善CME引起的心肌细胞损伤具有重要的临床意义。为此,我们利用大鼠自体微栓塞模型,通过CME后心肌细胞凋亡调控基因、凋亡执行蛋白表达的改变以及血流动力学检测,探讨⑴CME对心肌细胞凋亡及左心室功能的影响。⑵粒细胞集落刺激因子(G-CSF)对冠脉微栓塞心肌细胞凋亡的影响及其细胞内信号传导机制。一、冠状动脉微栓塞对心肌细胞凋亡及左心室功能的影响目的:探讨冠脉微栓塞对大鼠心肌细胞凋亡及左心室功能的影响。方法:采用清洁级健康雄性SD大鼠56只,体重280～320 g。随机分为假手术组(Sham组n=24)和微栓塞组(CME组n=32);根据不同观察时间点再分为术后3d(天)、7d、14d及28d四个亚组,每亚组6-8只。CME组夹闭升主动脉同时自左室腔注入自体微血栓混悬液,Sham组则注入等容量的生理盐水。采用HE及Masson染色观察心肌组织病理学改变;Real-time PCR及免疫组化检测心肌细胞Bcl-2、Bax、Fas、Fas-L等凋亡调控基因mRNA及其蛋白的表达;采用Western blot方法检测Caspase3、Caspase9和裂解PARP蛋白的表达;应用超声心动图及有创血液动力学检测大鼠左心功能的变化。结果:⑴HE染色显示CME术后可见心内膜下多中心小灶性心肌缺血、坏死伴白细胞浸润。Masson染色显示CME后心肌微小纤维灶形成,且多分布于心内膜区。⑵与Sham组相比较,CME组术后Bax、Fas及Fas-L mRNA及其蛋白的表达水平明显增高,Bcl-2/Bax的比值明显降低(7d:0.18±0.04 vs 2.98±0.49),术后7d达高峰(P<0.01)。⑶CME组Caspase-3、Caspase-9及裂解PARP蛋白表达明显高于Sham组,同样在术后7d达高峰(P<0.01)。⑷CME组凋亡指数较Sham组明显增高(7d:17.2±1.9 vs 1.2±0.6)(P<0.01);LVEF、LVSP及±dp/dtmax较Sham组明显降低(P<0.01)。结论:冠脉微栓塞早期即可通过改变凋亡调控基因的平衡,启动、激活Caspase级联反应,促进心肌细胞凋亡,降低左室功能。二、粒细胞集落刺激因子对冠脉微栓塞心肌细胞凋亡的影响目的:探讨粒细胞集落刺激因子对冠脉微栓塞心肌细胞凋亡的影响。方法:清洁级雄性SD大鼠88只,体重280～320g,随机分成CME组(32只)、G-CSF组(重组粒细胞集落刺激因子干预组32只)和Sham组(24只)。G-CSF组CME术后2小时起给予皮下注射重组粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)100ug.kg-1.d-1持续5天,其余两组给予等容生理盐水。术后3d、7d、14d及28d处死动物(每个亚组6-8只)。以HE染色观察心肌组织病理学改变;Real-time PCR及免疫组化检测心肌细胞Bcl-2、Bax、Fas、Fas-L等凋亡调控基因mRNA及其蛋白的表达;采用Western blot方法检测Caspase3、Caspase9和裂解PARP蛋白的表达;应用超声心动图及有创血液动力学评定大鼠的左心功能。结果:⑴HE染色显示G-CSF组心内膜下心肌微梗死灶的面积比CME组明显减轻。⑵与Sham组相比,CME组与G-CSF组Bax、Fas、Fas-L及Bcl-2的mRNA表达均有不同程度升高;与CME组比较,G-CSF组术后Bcl-2的mRNA表达增强、Bax、Fas及Fas-L的mRNA表达均有不同程度减弱,Bcl-2/Bax比值明显升高(7d:2.07±0.29 vs 0.18±0.04),差异有显著意义(P< 0.05或0.01)。⑶与Sham组相比,CME组与G-CSF组术后Caspase-3、Caspase-9及裂解PARP蛋白表达有不同程度增强;与CME组比较,G-CSF组术后Caspase-3、Caspase-9及裂解PARP蛋白表达明显减弱,差异有显著意义(P<0.05或0.01)。⑷与Sham组相比,CME组与G-CSF组术后心肌细胞凋亡指数(%)有不同程度升高(7d:17.2±1.9、6.1±1.0 vs 1.2±0.6),与CME组比较,G-CSF组术后心肌细胞凋亡指数明显降低,差异有显著意义。(P<0.05或0.01)。⑸CME组与G-CSF组较Sham组LVSP、±dp/dtmax及LVEF均有显著性降低,与CME组比较,G-CSF组LVSP、±dp/dtmax及LVEF明显升高,差异有显著意义(P<0.05或0.01)。结论:G-CSF可明显减少冠脉微栓塞后Bax、Fas及Fas-L的mRNA表达,上调Bcl-2,升高Bcl-2/Bax比值;同时减少Caspase-3、Caspase-9的活性及PARP蛋白的裂解,减轻心肌细胞凋亡,改善左心功能。三、JAK2/STAT3通路在G-CSF减轻冠状动脉微栓塞心肌细胞凋亡中的介导作用目的:探讨JAK2/STAT3细胞内信号传导通路在G-CSF减轻冠状动脉微栓塞心肌细胞凋亡中的作用。方法: SD大鼠152只,体重280-320g,随机分成CME组(32只)、G-CSF组(32只)、AG490组(JAK2特异性抑制剂组32只)、雷帕霉素组(STAT抑制剂组32只)和Sham组(24只)。G-CSF组、AG490组及雷帕霉素(RPM)组术后2h起给予皮下注射rhG-CSF 100μg.kg-1.d-1持续5天,同时AG490组及RPM组分别给予AG490溶液腹腔注射5mg.kg-1.d-1及RPM溶液0.4mg. kg-1.d-1,其他组给予等容生理盐水。术后3d、7d、14d及28d处死动物(每个亚组6-8只)。以HE染色观察心肌组织病理学改变;Real-time PCR及免疫组化检测心肌细胞Bcl-2、Bax、Fas、Fas-L等凋亡调控基因mRNA及其蛋白的表达;采用Western blot方法检测Caspase3、Caspase9和裂解PARP蛋白的表达以及t-JAK2、p-JAK2、t-STAT3以及p-STAT3蛋白的表达;应用超声心动图及有创血液动力学评定大鼠的左心功能。结果:⑴HE染色显示AG490组与RPM组心内膜下心肌微梗死灶的面积较G-CSF组明显增加。⑵与Sham组比较,CME组、G-CSF组、AG490组及RPM组Bax、Fas、Fas-L及Bcl-2 mRNA的表达均有不同程度升高;与G-CSF组相比,AG490组及RPM组Bax、Fas及Fas-L mRNA的表达均有不同程度升高,Bcl-2 mRNA的表达减弱,Bcl-2/Bax的比值明显低于G-CSF组(7d:0.57±0.12、0.31±0.03 vs 2.07±0.29),差异有显著性(P<0.05或0.01)。⑶与Sham组相比,CME组、G-CSF组、AG490组及RPM组Caspase-3、Caspase-9及裂解PARP蛋白表达有不同程度增强;AG490组与RPM组Caspase-3、Caspase-9及裂解PARP蛋白表达较G-CSF组明显增强,差异有显著性(P<0.05或0.01)。⑷各组之间t-JAK2、t-STAT3差异无显著性(P>0.05), G-CSF组与RPM组p-JAK2蛋白表达差异无显著性(P>0.05),但较其他组明显增高(P<0.05或0.01),CME组、AG490组及Sham组p-JAK2差异无显著性(P>0.05)。G-CSF组p-STAT3蛋白表达较其他组明显增高(P<0.05或0.01),CME组、AG490组、RPM组及Sham组p-STAT3差异无显著性(P>0.05)。⑸与Sham组相比,各组术后心肌细胞凋亡指数(%)有不同程度升高,CME组、AG490组及RPM组术后心肌细胞凋亡指数较G-CSF组升高明显(7d:17.2±1.9、14.2±1.5、15.8±2.1 vs 6.1±1.0),差异有显著性(P<0.05或0.01)。⑹CME组、G-CSF组、AG490组及RPM组各时间点较Sham组LVSP、±dp/dtmax及LVEF均有显著性降低(P<0.05或0.01),与G-CSF组比较,CME组、AG490组和RPM组LVSP、±dp/dtmax及LVEF明显降低,差异有显著意义(P<0.05或0.01)。结论:G-CSF能激活JAK2/STAT3信号传导通路,无论是JAK2特异性抑制剂AG490,或者是STAT的抑制剂雷帕霉素,均能显著抑制G-CSF通过调节凋亡调控基因、减少凋亡执行蛋白活性来减轻微栓塞心肌细胞凋亡的功能,说明G-CSF是通过激活JAK2/STAT3细胞内信号传导通路来改善凋亡调控基因的失衡,减弱凋亡执行蛋白的表达,从而减少心肌细胞凋亡,改善左心功能。