研究背景及目的后纵韧带骨化(ossification of the posterior longitudinal ligament,简称 OPLL)是一种常见的脊柱韧带异位骨化(heterotopicossification,简称HO)疾病。由于椎管内的空间有限,随着骨化物的生长,易造成相应水平的脊髓或神经根受压损伤,导致肢体感觉、运动功能障碍,严重影响人类的健康与生活质量。流行病学调查发现,OPLL主要发生在颈椎和胸椎,该部位所对应的脊髓功能一旦受损,所造成的神经功能障碍往往是广泛的,且对患者生活质量甚至生存时间造成严重的影响。目前有效的治疗方式是通过手术切除骨化物直接减压或通过扩大椎管容积间接减压解除骨化物对脊髓的直接压迫,但该部位手术风险高,手术过成中由于骨化物与硬脊膜往往存在不同程度的黏连,术者往往选择不切除或部分切除骨化物的手术方式,这也对术者的经验和技术提出了很高的要求。术后还存在骨化物继续生长甚至生长加速的情况,使得患者承受二次手术的风险。相关的病因学研究显示,年龄、肥胖、饮食、糖尿病、运动或脊柱的异常活动所造成的机械刺激、某些内分泌疾病,如甲状旁腺功能减退、肢端肥大症等都可以增加OPLL的患病风险,说明OPLL存在多种可能的致病因素。不论何种因素致病,最终都表现为后纵韧带局部异位骨化的形成以及逐渐增大的病理过程。因此,寻找OPLL中骨化物生成及生长的机制一直是该领域的研究热点之一。既往的研究显示许多成骨相关通路在后纵韧带骨化形成的过程中均被激活,包括 TGF-β/BMP 细胞通路、Wnt/β-catenin 通路、JAK-STAT 通路、PI3K/AKT 通路等。这些通过在骨折愈合、骨骼发育过程中也同样发挥作用。因此我们推测这些通路的激活可能存在更上游、更特异的调控因素。miRNA在人体发育、疾病、肿瘤中广泛发挥调控作用。体内正常的成骨过程也受到多种miRNA的调控。我所在的课题组通过比较PLL和OPLL细胞后发现,两者miRNA表达谱存在明显的差异,并初步发现miR-10a在后纵韧带骨化过程中发挥重要作用。miRNA对细胞功能的调控是一个复杂的网络,因此进一步深入研究miRNA在OPLL中发挥的调控作用及其机制,有助于进一步理解OPLL的发病机制,同时miRNA作为一种小分子也具有临床转化的潜力。基于以上理解,我所在的课题组通过测序发现OPLL与非OPLL患者后纵韧带miRNA表达谱存在明显差异,并且发现了 miR-10a-3p在后纵热带成骨过程中发挥重要作用。因此我们假设后纵韧带骨化过程中存在miRNA调控网络的异常。通过对之前测序数据的进一步分析,发现miR-181a-5p在OPLL患者后纵韧带组织中的表达量明显升高,同时也是表达量前十的miRNA之一,并且对其预测靶标进行GO通路分析显示与成骨相关通路关系密切,因此我们miR-181a-5p可能在后纵韧带骨化过程中发挥重要作用。本研究通过探索miR-181a-5p在原代后纵韧带细胞中的生物学特性,应用分子生物学方法分析并验证miR-181a-5p的靶基因,进而阐明miR-181a-5p在后纵韧带骨化过程中的调控机制,为后纵韧带骨化的治疗提供可能的分子靶点。第一部分:miR-181a在后纵韧带骨化中的表达及功能研究方法:(1)对PLL与OPLL miRNA、mRNA测序数据(GSE69787)进行生物信息学分析,构建成骨相关miRNA/mRNA相互作用网络,结合OPLL测序结果中表达量排序表筛选可能在OPLL成骨过程发挥关键调控作用的miRNA。收集临床后纵韧带组织标本,通过RT-qPCR验证miR-181a在OPLL与非OPLL(以下简称PLL)患者之间的表达差异。(2)收集临床后纵韧带组织标本进行后纵韧带原代细胞培养,成骨诱导培养后检测成骨相关基因表达变化及miR-181a表达变化。(3)通过转染miR-181a-5p及-3p mimics或inhibitors,在PLL细胞中过表达miR-181a,在OPLL细胞中抑制miR-181a表达,成骨诱导21天后通过茜素红及ALP染色评价其成骨能力,通过RT-qPCR和western-blot检测成骨相关基因在mRNA水平及蛋白水平的表达变化。结果:(1)miRNA/mRNA成骨相关作用网络中,miR-181a-5p在OPLL细胞中表达量最高,位于所有差异表达miRNA中的第7位,为所有上调miRNA中的第4位。通过对10例OPLL来源及PLL来源韧带组织进行RT-qPCR检测发现:OPLL韧带中miR-181a-5p及-3p表达量均明显高于PLL来源韧带组织。(2)后纵韧带原代细胞在成骨诱导培养下,RT-qPCR检测证实成骨相关基因(RUNX2、OSX、OPN、ALP)表达量逐渐升高,RT-qPCR检测发现miR-181a-5p及-3p表达水平升高。(3)分组处理后,过表达miR-181a-5p的PLL细胞钙结节形成、碱性磷酸酶活性增加,成骨相关基因在mRNA水平及蛋白水平表达量明显高于对照组及阴性对照组,过表达miR-181a-3p的PLL各指标未见明显改变。与之相反,抑制miR-181a-5p表达的OPLL细胞成骨能力下降,而抑制miR-181a-3p的OPLL细胞成骨能力未见明显改变。结论:生信分析表明OPLL中miR-181a-5p与成骨相关通路关系密切,且在OPLL细胞中表达量较高,后纵韧带患者的颈椎后纵韧带组织中miR-181a-5p和-3p表达量升高。由颈椎后纵韧带培养的原代细胞也具有这一表达差异。过表达/抑制miR-181a-5p会明显影响颈椎韧带细胞成骨诱导后成骨相关基因的表达。以上结果表明miR-181a-5p及-3p可能参与后纵韧带细胞骨化的调控过程。第二部分:miR-181a-5p靶基因的筛选与验证方法:(1)根据此前生信分析结果,通过RT-qPCR检测miR-181a成骨相关靶基因在PLL和OPLL细胞间的差异表达。(2)在PLL细胞中过表达miR-181a-5p和-3p,通过RT-qPCR检测预测靶基因的表达变化;(3)在pMir-Reporter载体中插入包含待检测靶基因3‘UTR结合位点野生型(wildtype,WT)及突变型(mutation,MUT)序列,通过双荧光素酶报告基因系统验证miR-181a-5p和-3p与靶基因的关系。(4)通过RT-qPCR、Western-blot检测过表达、抑制miRNA后靶基因在后纵韧带细胞中的表达变化,分析其与miR-181a-5p及-3p表达的相关性。结果:(1)RT-qPCR 结果显示:8 个(PBX1、ACAN、S1PR1、GLI2、HAND2、TLL1、HOXA11、RPS6KA3)可能的靶基因中有 4 个(PBX1、ACAN、S1PR1、HOXA11、RPS6KA3)在OPLL细胞中表达量下降。(2)RT-qPCR结果显示:PLL细胞过表达miR-181a-5p可以使8个候选靶基因中PBX1及ACAN的mRNA表达水平下降,过表达miR-181a-3p对8个候选靶基因表达量无明显影响。(3)通过TargetScan网站预测miR-181a-5p与PBX1、ACAN结合位点,构建双荧光素酶报告基因实验载体,通过293T细胞共转染后检测荧光强度,过表达miR-181a-5p 可以降低 PBX1 WT 和 ACAN WTFirefly luciferase/Renialla luciferase 比值,而过表达 miR-181a-3p 后 Fireflyluciferase/Reniallaluciferase 比值未见明显改变。(4)RT-qPCR、Western-blot检测结果显示:PLL细胞过表达miR-181a-5p后PBX1、ACAN表达量在mRNA水平及蛋白水平均明显下降,过表达miR-181a-3p未见表达量明显改变。OPLL细胞抑制miR-181a-5p表达后PBX1、ACAN表达量在mRNA水平及蛋白水平均明显上升,抑制miR-181a-3p表达后未见PBX1、ACAN表达量出现明显变化。结论:PBX1 及 ACAN 为 miR-181a-5p 的靶基因,miR-181a-3p对PBX1 及ACNA不具有靶向调控作用。第三部分:miR-181a-5p调控后纵韧带细胞成骨机制的研究方法:(1)收集颈椎骨化和非骨化后纵韧带临床标本,通过原位杂交组织化学结束检测PBX1、AC AN在组织中mRNA表达量。(2)下调OPLL细胞中PBX1、ACAN表达,观察成骨相关基因表达量变化。(3)回复实验(rescue assay)进一步验证miR-181a-5p靶向PBX1对后纵韧带细胞成骨的调控。(4)通过免疫共沉淀方法研究PBX1对成骨相关基因启动子区域组蛋白表观遗传修饰水平的调控作用。结果:(1)原位杂交组织化学结果显示,在未发生钙化的颈椎后纵韧带组织中PBX1及ACAN的表达量明显高于发生钙化的后纵韧带组织。(2)RT-qPCR及western-blot结果显示,siPBX1显著上调PLL及OPLL细胞内骨化相关基因的表达,而siACAN对PLL细胞内骨化相关基因表达无影响,对OPLL细胞内ALP及OCN具有上调作用,而对RUNX2及OSX无影响。(3)在OPLL细胞中抑制分别干扰PBX1、ACAN表达后,茜素红、ALP染色显示OPLL细胞成骨诱导后钙沉积增加,ALP活性增加,而抑制miR-181a-5p表达后,OPLL细胞经成骨诱导后钙沉积减少,ALP活性降低。在抑制miR-181a-5p表达的同时干扰PBX1表达,OPLL经成骨诱导后钙沉积及ALP活性回复。而抑制miR-181a-5p表达同时干扰ACAN表达并不能完全回复OPLL细胞的钙沉积效果及ALP活性。RT-qPCR及western-blot结果显示,转入miR-181a-5p抑制体后的OPLL细胞在成骨诱导培养后RUNX2、OSX、ALP、OCN表达降低。同时干扰PBX1表达可以回复RUNX2、OSX、ALP、OCN的调控效果。而同时干扰ACAN表达并不能回复RUNX2、OSX的表达变化。(4)PLL细胞转染miR-181a-5p模拟物后,ChIP结果显示,结合于OCN及OSX启动子区域的PBX1减少,RUNX2的结合增加,HOXA10结合未见明显改变,组蛋白H3K9乙酰化水平增加,2-甲基化水平降低,转录活性升高。而OPLL转染miR-181a-5p抑制物后结果相反。结论:miR-181a-5p可以在后纵韧带细胞中靶向PBX1及ACAN,但主要通过靶向PBX1调控后纵韧带细胞的成骨能力。miR-181a-5p靶向抑制PBX1表达,进而通过调控下游骨化相关基因组蛋白表观遗传修饰影响转录表达。第四部分:miR-181a-5p对后纵韧带细胞成骨分化及OPLL疾病作用的在体验证方法:通过慢病毒构建稳定表达miR-181 a-5p mimic、miR-181 a-5p inhibitor、siPBX1,及siNC的PLL细胞,4天后与Bio-Oss Collagen支架共培养2天。将带细胞支架植入裸鼠背部皮下构建异位骨化模型,6周后行micro-CT观察体内成骨效果,并通过免疫组化检测移植材料中骨化相关基因及miR-181a-5p靶基因PBX1的表达变化构建miR-181a-5p agomir及antagomir,分别注入OPLL工具鼠(ttw小鼠)的鼠尾静脉,18周后通过micro-CT检测各组ttw小鼠后纵韧带骨化情况,评估miR-181a-5p对OPLL病程的在体影响;并通过免疫组化方法检测后纵韧带组织中骨化相关基因及miR-181a-5p靶基因PBX1的表达变化,对miR-181a-5p调控OPLL的机制作进一步验证。结果:裸鼠皮下异位骨化标本micro-CT数据显示过表达miR-181a-5p或干扰PBX1均可导致移植材料内BV/TV值及BMD值显著增加,而抑制miR-181a-5p表达后,上述参数显著降低;此外,免疫组化结果显示过表达miR-181a-5p显著上调移植材料内骨化相关基因OCN的表达,而下调PBX1表达,抑制miR-181a-5p时结果相反,说明miR-181a-5p在裸鼠异位骨化模型中促进后纵韧带细胞成骨分化进程。结论:miR-181a-5p在体内可下调靶基因PBX1的表达,促进骨化相关基因表达,进而促进后纵韧带骨化的发生。