研究背景与目的随着人们对于中药认识的不断深入,“配伍禁忌”问题受到极大地重视与关注。配伍禁忌是指一般情况下不宜相互配合使用的药物,传统中药的配伍禁忌主要包括“十八反”、“十九畏”。“十八反”是沿袭数千年的用药禁忌,其中乌头与半夏是“十八反”中禁止配伍使用的典型药对,《中华人民共和国药典》（2010版）在川乌、制川乌、草乌、制草乌及附子项下均指出不宜与半夏同用。“十八反”虽为历代大部分医家认可和遵循,但古今医家对乌头与半夏是否为配伍禁忌存有异议,用此药对治病者屡见不鲜,近年来两者合用于临床应用中也越来越广泛。据文献报道乌头与（生、法）半夏配伍后毒性差别较大,其配伍究竟反与不反、为什么反、怎么反?其反与不反的科学内涵值得,深入研究。基于上述背景,本论文在国家重点基础研究发展计划（“973计划”）项目资助下,围绕中药配伍禁忌理论关键科学问题和“半蒌贝蔹及攻乌”中乌头与半夏的用药特点,基于符合现代科学认知规律的色谱与质谱联用分析技术,从“毒性-成分-毒代”角度入手,初步回答草乌与半夏反与不反的科学问题,为今后指导和保障临床用药安全有效奠定基础;同时建立一套用于中药急性毒性评价与体内外成分分析的方法,为中药相关问题的研究提供思路和应用实例。研究方法第一部分 生半夏化学成分鉴别及生半夏与法半夏化学成分差异研究利用UFLC/Q-TOF-MS分析生半夏中化学成分;采用主成分分析（PCA）和T检验分析分析生半夏与法半夏化学成分的差异。第二部分 草乌化学成分分离鉴别及毒性评价利用UFLC/Q-TOF-MS分析草乌中的化学成分;利用萃取等手段对草乌生物碱进行分离制备,并通过UFLC/Q-TOF-MS鉴别3类生物碱;通过体外细胞毒性实验评价3类成分的毒性。第三部分 草乌与（生、法）半夏配伍（1:1）的急性毒性实验通过预实验确定的Dm和Dn,将实验分为6组,每组小鼠20只,灌胃给药,观察并记录小鼠的中毒症状和死亡情况14 d,以小鼠死亡率为指标,采用Bliss法计算LD50。第四部分草乌与（生、法）半夏配伍（1:1）的化学成分研究利用UHPLC/Q-TOF-MS分析草乌与法半夏配伍合煎液与合并液化学成分变化;草乌与生半夏配伍合煎液与合并液化学成分变化;草乌与法半夏配伍合煎液和草乌与生半夏配伍合煎液化学成分差异。第五部分草乌与（生、法）半夏配伍（1:1）3个毒性成分毒代动力学变化研究采用雄性SD大鼠48只,随机分为草乌醇提组（A）、草乌与法半夏醇提组（B）、草乌与生半夏醇提组（C）、草乌水提组（D）、草乌与法半夏水提组（E）、草乌与生半夏水提组（F）,分别单次以《中华人民共和国药典》（2010版）中草乌最大剂量给药,设给药前和给药后共13个采血时间点,采用LC-MS/MS检测血浆样品,血药浓度-时间数据经DAS2.0软件处理计算毒代动力学参数。第六部分草乌和半夏质量控制研究采用《中华人民共和国药典》（2010版）高效液相色谱法（附录ⅥD）、显微鉴别法（附录ⅡC）和薄层色谱法（附录ⅥB）对草乌和半夏药材进行质量控制。研究结果第一部分生半夏化学成分鉴别及生半夏与法半夏化学成分差异研究检测到生半夏中90个化合物,分别为7个生物碱类,9个聚醇类,13个脂肪酸甘油脂类,5个黄酮类,13个溶血磷脂酰胆碱类,10个醇氨类,13个氨基酸类,11个酰胺类,3个脂肪酸类,6个其他化合物,其中可引起炎症反应及神经元髓鞘脱失和不同程度变性的溶血磷脂酰胆碱是在半夏中首次发现。溶血磷脂酰胆碱类大量减少和增加甘草成分中的甘草素、甘草酸、甘草次酸等是法半夏毒性减小的原因。第二部分草乌化学成分分离鉴别及毒性评价检测到草乌中120个生物碱（30个潜在的新生物碱）,其中38个醇胺型和酯型生物碱,82个脂型生物碱（母核质量数为556有18个生物碱,母核质量数为570和572有21个生物碱,母核质量数为586有12个生物碱,31个其它脂型生物碱）。通过UFLC/Q-TOF-MS鉴定3类化合物分别为醇胺型、酯型、脂型生物碱;毒性研究结果发现醇胺型生物碱和脂型生物碱的细胞毒性较小,但酯型生物碱具有明显的细胞毒性,因此从体外细胞水平上确定草乌中主要毒性成分为酯型生物碱。第三部分草乌与（生、法）半夏配伍（1:1）的急性毒性实验结果显示草乌醇提液的LD50为7.96 g（生药）·kg-1,草乌与法半夏醇提合煎液的LD50为12.20 g（生药）·kg-1,草乌与生半夏醇提合煎液的LD50为4.40 g（生药）·kg-1。与草乌相比,草乌与生半夏配伍后LD50减小,表明配伍后急性毒性增大;与草乌组相比,草乌与法半夏配伍后LD50增大,表明配伍后急性毒性减小。说明生草乌与法半夏配伍不反,生草乌与生半夏配伍反。第四部分草乌与（生、法）半夏配伍（1:1）的化学成分研究结果显示草乌与法半夏配伍水提合煎液与其合并液比较,单酯型生物碱含量降低而醇胺型生物碱含量增加;醇提合煎液与其合并液比较,双酯型生物碱含量明显降低。草乌与生半夏配伍水提合煎液与其合并液比较,单酯型生物碱含量增加;醇提合煎液与其合并液比较,双酯型生物碱含量增加。草乌与生半夏配伍水提合煎液与草乌与法半夏配伍水提合煎液比较,双酯型和单酯型生物碱均明显增加,醇胺型生物碱明显降低。草乌与生半夏配伍醇提合煎液较草乌与法半夏配伍醇提合煎液除醇胺型生物碱尼奥林的含量减小外,其它生物碱含量均增大。说明草乌与（生、法）半夏配伍的反与不反主要的物质基础是草乌中酯型生物碱含量的升高或者降低。第五部分草乌与（生、法）半夏配伍（1:1）3个毒性成分毒代动力学变化研究从整体上看,草乌与生半夏配伍醇提合煎组与草乌醇提组相比,乌头碱、新乌头碱、次乌头碱AUC（0-t）增大,Cmax增大;草乌与法半夏配伍醇提合煎组与草乌醇提液相比,乌头碱、新乌头碱、次乌头碱AUC（0-t）明显减小,Cmax明显减小。水提药代动学参数不稳定,但从药时曲线可看出草乌与生半夏配伍水提合煎液中乌头碱和新乌头碱血药浓度突然升高,可见生半夏可使草乌中双酯型生物碱的吸收程度与速率增加;法半夏可使草乌中双酯型生物碱的吸收程度与速率减小。第六部分草乌和半夏质量控制研究《中华人民共和国药典》（2010版）规定草乌新乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的总量应为0.10%～0.50%,测得其总量为0.12%,表明草乌药材质量合格;生半夏中琥珀酸的含量不能少于0.25%,测得其含量为0.30%,显微与薄层结果也表明半夏药材质量合格。本研究针对“十八反”中乌头与半夏的配伍禁忌,从“毒性-成分-毒代”角度入手,对反与不反的科学内涵进行研究,初步得出草乌与生半夏反而与法半夏不反这一结论。这对丰富和发展中药配伍禁忌理论具有重要意义,为今后指导和保障临床用药安全有效奠定基础。