环二腺苷酸(cyclic diadenosine monophosphate,c-di-AMP)是新近发现的一种核苷类第二信使分子,调控着细菌的多种生理功能,包括渗透压的调节、脂肪酸的合成以及离子的运输等。二腺苷酸环化酶(含有保守的DAC结构域)和磷酸二酯酶(含有保守的DHH-DHHA1或HD结构域)分别负责c-di-AMP的合成与降解。c-di-AMP普遍在翻译后水平发挥功能,通过影响受体蛋白的结构与功能来调控细菌的各种生理过程。近来研究表明,c-di-AMP也可以通过核糖开关在转录水平或转录后水平调控细菌的生长代谢过程。核糖开关是位于转录本5’-UTR或3’-UTR的RNA元件,在与配体特异结合后,导致自身结构发生变化,从而调节下游基因的表达。Rfam数据库显示,苏云金芽胞杆菌BMB171中存在四个c-di-AMP核糖开关,我们依据它们在基因组上的先后顺序,将其分别命名为Bt1、Bt2、Bt3和Bt4。Bt1下游基因编码假定蛋白,Bt2下游基因编码Kdp家族蛋白,Bt3下游基因编码氨基酸透性酶,Bt4下游基因同样编码假定蛋白。本研究首先通过序列比对,发现这四个核糖开关广泛分布于Bacillus cereus group菌株中,且在基因组上的位置比较保守。接着我们对这四个核糖开关的二级结构进行了分析。经Softberry网站的FindTerm软件的预测得知,核糖开关Bt2和Bt3适配体区的下游存在不依赖于p因子的终止子结构,因此,这两个核糖开关通过形成终止子或抗终止子结构在转录水平上调节下游基因的表达。而在核糖开关Bt1和Bt4适配体区的下游并没有预测到终止子结构,可能存在其他未知的调控模式。我们首先构建了表达载体pHT1K-PxlacZ(Px为P1、P2、P3或P4,分别表示含有核糖开关Bt1、Bt2、Bt3或Bt4的启动子区),将其分别电转入出发菌株BMB171和c-di-AMP合成酶双敲菌株ΔdisAΔcdaS中,实验结果表明在低c-di-AMP浓度的ΔdisAΔcdaS菌株中,β-半乳糖苷酶活性升高。其次通过RT-qPCR实验发现,AdisAΔcdaS菌株中四个核糖开关下游基因的转录量也都升高。接着我们将表达载体pRP-Btx-/acZ(x 表示 1、2、3 或 4)和 pET28b-disA 共转化入大肠杆菌 BL21(DE3)中,通过对β-半乳糖苷酶活性的验证发现当c-di-AMP浓度升高时,β-半乳糖苷酶活性降低,因此异源验证了核糖开关的下游基因受到c-di-AMP的抑制。最后通过双荧光报告系统进一步验证了这四个核糖开关属于“关”的核糖开关。综上所述,核糖开关Bt1、Bt2、Bt3和Bt4与c-di-AMP作用后,能够抑制下游基因的表达。接下来,本课题选取核糖开关Bt2下游的kdp操纵子进行了深入研究。我们首先通过RT-PCR实验确定了 BMB171中的kdp操纵子的六个结构基因sipW、kdpF、kdpA、kdpB、kdpC和kdpD存在共转录。然后通过RT-qPCR实验发现kdp操纵子在钾离子浓度为1 mM时的表达量是钾离子浓度为30 mM时的10倍以上,低钾环境能够诱导kdp操纵子的表达。接下来,我们将含有表达载体pHT1K-P0-lacZ(P0表示仅含启动子区,不含核糖开关Bt2)和pHT1K-P2-lacZ的菌株在高钾与低钾培养基中培养,β-半乳糖苷酶活性实验的结果表明,BMB171中kdp操纵子的启动子活性并不受低钾环境的影响,核糖开关Bt2能够感应胞内钾离子的浓度变化从而调控kdp操纵子的表达。当钾离子的浓度低时核糖开关处于“开”的状态,下游基因表达量高,当钾离子的浓度高时核糖开关处于“关”的状态,下游基因表达量低。最后我们敲除了染色体上的核糖开关Bt2和kdpD基因,RT-qPCR实验结果表明ΔBt2菌株中的ksp操纵子不再受到低钾环境的诱导,而ΔkdpD菌株中的kdp操纵子仍可受到低钾环境的诱导。以上结果表明,BMB171菌株中kdp操纵子5’-UTR的核糖开关Bt2为调控其表达的关键元素,它既能够响应细菌体内的钾离子浓度,又可以受到c-di-AMP的调控。总之,本课题不仅证实了 BMB171菌株中四个受c-di-AMP调控的核糖开关,而且发现其中Bt2不仅受c-di-AMP,还受K+的调控,丰富了钾离子转运系统kdp操纵子的调控机制。