【摘 要】
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目的:胶原蛋白作为细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）中最主要的组成成分之一,其分布遍布全身各个器官与组织。Ⅰ型胶原蛋白是含量最丰富的胶原蛋白,由两条a（16）链和一条a（17）链构成。Ⅰ型胶原蛋白含量的变化经常与许多临床疾病相关,如肝脏纤维化、成骨不全、埃勒斯-丹洛斯综合征（Ehlers-Danlos Syndrome,EDS）等。质谱定量分析作为一种新兴的蛋白质定量方
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目的:胶原蛋白作为细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）中最主要的组成成分之一,其分布遍布全身各个器官与组织。Ⅰ型胶原蛋白是含量最丰富的胶原蛋白,由两条a（16）链和一条a（17）链构成。Ⅰ型胶原蛋白含量的变化经常与许多临床疾病相关,如肝脏纤维化、成骨不全、埃勒斯-丹洛斯综合征（Ehlers-Danlos Syndrome,EDS）等。质谱定量分析作为一种新兴的蛋白质定量方法,可以通过目的蛋白的特异性肽段实现对目的蛋白的定量,是一种具有高灵敏性和高精准的定量方法。然而,基于质谱分析对I胶原蛋白进行定量的研究仍有待发展。因此,本研究尝试建立一种使用纳米液相色谱串联质谱（Nano-liquid chromatography tandem mass spectrometry,nano-LC/MS/MS）对LX-2人肝星状细胞（LX-2 human hepatic stel late cell）培养基中Ⅰ型胶原蛋白a（16）（Collagen alpha-1（I）chain,COLIA1）进行定量分析的方法,为Ⅰ型胶原蛋白的相关研究提供参考。方法:实验包括特异性肽段的筛选与COL1A1的定量两部分。1、特异性肽段的筛选。（1）使用胰蛋白酶消化人胎盘Ⅰ型胶原蛋白,并使用纳米液相色谱串联质谱和Pinpoint软件分析产物肽,筛选出可以用于定量COL1A1的特异性肽段。（2）将LX-2人肝星状细胞（P37代）复苏并传代（1传4）,LX-2细胞（P38代）在37℃、5%CO2条件下以每100 mm皿1.5×106个细胞的密度在含有2%胎牛血清（Fetal bovine serum,FBS）的10 m L DMEM中培养,48 h后将细胞培养基更换为含有0.5%FBS和200mM-抗坏血酸的10m L DMEM并继续培养,48 h后回收所有LX-2细胞培养基（P38代）共40 m L。（3）采用胃蛋白酶消化和盐析沉淀的方法从LX-2细胞培养基（P38代）中提取Ⅰ型胶原蛋白。（4）使用胰蛋白酶对提取到的Ⅰ型胶原蛋白进行消化,对得到的肽段产物进行脱盐。（5）使用纳米液相色谱串联质谱分析验证LX-2细胞培养基（P38代）样品中的特异性肽段的真实性。2、COL1A1的定量。（1）在确定了COL1A1的特异性肽段之后,继续培养三代LX-2细胞（P39代,P40代,P41代）并分别回收每一代细胞培养基上清,作为实验组样本。（2）准备含有0.5%FBS和200mM-抗坏血酸的DMEM作为对照组样本,共三组。（3）根据筛选出的特异性肽段的氨基酸序列,购买了特异性肽段的合成肽,作为本次实验的合成肽组（4）采用胃蛋白酶消化和盐析沉淀的方法从实验组与对照组培养基中提取Ⅰ型胶原蛋白,并使用胰蛋白酶对提取到的Ⅰ型胶原蛋白进行消化,得到的肽段产物进行脱盐处理。（5）向肽段产物中加入使用稳定同位素标记的特异性肽段作为内标,并使用纳米液相色谱串联质谱定量COL1A1的含量。根据样品中未标记和稳定同位素标记肽段峰面积的比值,来计算LX-2细胞培养基中COL1A1的含量。结果:1、纳米液相色谱串联质谱分析显示,在人胎盘Ⅰ型胶原蛋白中筛选出四个候选肽段,分别为GVVGLP*GQR,GAAGLP*GPK,GVQGPP*GPAGP,GLTGSP*GSP*GPDGK。与其他三个肽段相比,肽段GVVGLP*GQR显示出比其他肽段更强特异性的信号强度。2、细胞培养基（P38代）培养基中的肽段GVVGLP*GQR的保留时间和子离子（Q3）过渡与人胎盘Ⅰ型胶原蛋白中的肽段GVVGLP*GQR的保留时间和子离子（Q3）过渡以及合成肽的保留时间和子离子（Q3）过渡相同。3、实验组培养基中COL1A1含量为40.22±10.71 ng/m L,对照组培养基中COL1A1含量为1.44±0.45 ng/m L。结论:1、肽段GVVGLP*GQR是Ⅰ型胶原蛋白α1（COL1A1）的特异性肽段。2、基于纳米液相色谱串联质谱的分析方法可以通过特异性肽段定量培养基中Ⅰ型胶原蛋白α1蛋白的含量。
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