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背景:肝癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率位居全部恶性肿瘤第二位。肝癌的高复发率、易转移和化疗耐药是影响患者长期生存的重要因素。肿瘤干细胞(Cancer Stem Cell,CSC)是肿瘤中拥有自我更新和多向分化的特性的一类特殊细胞,其与肿瘤的复发、转移和化疗耐药密切相关。CD44是肝癌、结肠癌等多种CSC的重要分子标志物,其与CSC的干性维持和自我更新关系紧密。自然杀伤(Natural Killer,NK)细胞可识别杀伤CD44高表达的胰腺癌和胶母细胞瘤CSC,当CSC发生分化且CD44表达下降时NK细胞对其识别杀伤不再敏感。NK细胞能否识别杀伤肝癌CSC,这种杀伤作用是否与CD44相关仍是未知。此外NK细胞识别杀伤肝癌CSC的潜在识别靶点及其调控机制也尚未明确。基于此本文尝试通过研究NK细胞能否识别杀伤肝癌CSC,及此过程中的潜在识别靶点和调控机制,为后续NK细胞治疗肝癌CSC改善肝癌患者预后提供支持。方法:1.HepG2 肝癌细胞系转染 Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc(OSKM)和 shMBD3构建CD44不同表达水平的诱导肿瘤干细胞(induced CSC,CD44high/intiCSC);2.使用ELISA、细胞毒性检测、CRISPRi和抗体拮抗等方法研究NK细胞对iCSC识别杀伤与CD44的关系;3.使用Western Blot和RT-PCR等方法寻找NK细胞识别杀伤iCSC的可能靶点;4.使用基因过表达、荧光素酶报告、突变miRNA结合位点和RNA免疫共沉淀等方法研究CD44 3’非编码区(3’UTR)调控ULBP2表达的机制;5.肿瘤成瘤验证CD44 3’UTR作为内源竞争性RNA(ceRNA)调控ULBP2表达增敏NK细胞识别杀伤。结果:1.OSKM转入HepG2细胞成功构建CD44intiCSC,联合导入shMBD3进一步增强CD44表达构建CD44high iCSC;2.NK细胞对iCSC有识别杀伤作用;3.敲低CD44降低NK细胞对CD44high/intiCSC的识别杀伤,其杀伤能力与iCSC中的CD44表达正相关;4.敲低CD44下调iCSC中NK细胞激活配体ULBP2表达;5.NK细胞通过ULBP2对iCSC进行识别杀伤;6.敲低CD44降低ULBP2 mRNA 的稳定性并增加 miRNA-34a 表达;7.miRNA-34a 可与 CD44 3’UTR(3021bp、4564bp)和ULBP2 3’UTR(1048bp)特异性结合并对其进行调控;8.过表达CD44 3’UTR可增强ULBP2 mRNA稳定性并上调其蛋白表达;9.CD443’UTR 竞争性结合 miRNA-34a 上调 ULBP2 表达;10.CD44 3’UTR 作为 ceRNA调控ULBP2表达增敏NK细胞对iCSC识别杀伤。结论:ULBP2是NK细胞识别杀伤iCSC的重要靶点;CD44 3’UTR作为ceRNA竞争性结合miRNA-34a,阻止其与ULBP2 mRNA 3’UTR结合介导的mRNA稳定性下降,进而上调ULBP2蛋白表达,最终增强NK细胞对iCSC识别杀伤。