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研究目的:建立可以同时、快速检测急性胃肠炎患者粪便中诺如病毒(Norovirus,NOV)、A组轮状病毒(Rotavirus,RV)、札如病毒(Sapovirus,SaV)、人腺病毒(Huma n Adenovirus,HAdV)、人星状病毒(Human Astrovirus,HAstV)的多重 qRT-PC R的技术。探讨2018年11至2019年11月镇江部分地区主要急性胃肠炎病毒的流行情况,急性病毒性胃肠炎患者临床特征以及当地NOV GⅡ基因型别分布特征,探讨流行的优势毒株及进化。研究方法:1、利用NOV GⅠ和GⅡ、A组RV的RNA片段构建重组质粒pACYC184-NOV-GⅠ、pACYC184-NOV-GⅡ 和 pACYC184-RV。合成质粒 pBluescript Ⅱ SK-SaV、pBluescr i-pt Ⅱ SK-HAstV 和 pBluescriptⅡ SK-HAdV。制备上述病毒的标准品。2、以制备的标准品为模板建立二步法qRT-PCR标准曲线,评价其各体系的灵敏度、特异性及重复性。3、在qRT-PCR的基础上将上述病毒引物和探针分成三组,每组含两种病毒引物和探针进行可行性组合,利用制备的标准品进行二步法多重qRT-PCR检测,建立标准曲线;评价各体系的灵敏度、特异性及重复性。4、选取2018年11月至2019年11月镇江部分地区临床诊断为急性胃肠炎121例患者粪便样本,采用上述建立的多重qRT-PCR进行检测粪便样本中的核酸,阐明该地区成人和婴幼儿急性胃肠炎病毒阳性检出率、患者年龄和性别分布、发病季节分布、临床症状特征等,分析主要急性胃肠炎病毒的流行病学情况。5、选取NOV GII阳性标本,扩增RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)区和衣壳VP 1区后进行测序,用GenBank进行相似性搜索,并应用Mega 7.0软件进行基因分型,应用邻近归并法(Neighbor-joining,N-J)构建遗传进化树,进行系统发育和同源性分析。研究结果:1、基于 qRT-PCR 检测 NOV GⅠ、NOV GⅡ、A 组 RV、SaV、HAdV 和 HAstV 的标准品的Ct值与不同稀释度的病毒RNA/DNA拷贝数之间具有良好的线性关系。运用建立qRT-PCR方法对其他急性胃肠炎病毒进行检测,均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。qRT-PCR 检测 NOV GⅠ、NOV GⅡ、A 组 RV、HAdV、SaV 和 H AstV限值分别为102、102、101、102、102、102和102,表明该方法具有良好的敏感度。qRT-PCR 检测 NOV GⅠ、NOV GⅡ、A 组 RV、HAdV、SaV 和 HAstV 变异系数 CV 最大分别为 1.56%、2.50%、1.75%、1.56%、2.35%和 2.39%,均<10%,结果表明所建立的检测体系具有良好的稳定性和重复性。2、建立同时检测 NOV GⅠ/NOV GⅡ、A 组 RV/HAdV、SaV/HAstV 多重 qRT-PCR标准曲线,其引物-探针与其他病毒均无交叉反应,灵敏度与qRT-PCR一致,组内变异系数小于10%。结果表明,建立的检测体系具有良好的特异性、灵敏度和重复性。3、2018年11月至2019年11月,共检测出NOV阳性率10.74%(13/121),NOV GI 检出阳性率 4.13%(5/121),NOV GⅡ 检出阳性率 6.61%(8/121);A 组RV检出阳性率15.70%(19/121);SaV检出阳性率2.48%(3/121);HAdV检出阳性率0.83%(1/121);HAstV未检出。在病毒感染患者性别分布上,男、女急性胃肠炎患者病毒检出阳性率差异均无统计学意义(P>0.05)。在病毒感染患者年龄段上,各年龄感染NOV GⅠ、SaV患者无统计学差异(P>0.05);NOV GⅡ在0-10岁年龄段中感染阳性率达16.00%,相比较其他年龄段,差异具有统计学意义(P<0.05)。A组RV感染主要发生在0-20岁年龄段,其中,A组RV在10-20岁年龄段中感染阳性率达31.30%,相比较其他年龄段,差异具有统计学意义(P<0.05)。HAdV感染主要发生在60岁以后老年人,差异无统计学意义(P>0.05)。在季节分布上,N OV GⅠ 2月份阳性率最高,达22.22%;NOV GⅡ 3月份阳性率最高,达25%;A组RV阳性率15.70%,11月份阳性率最高,达30.00%;HAdV阳性率0.83%,仅于4月检出;SaV阳性率2.48%,1月份阳性率最高,达20.00%。4、多重qRT-PCR检出GⅡ阳性标本8份,与测序结果一致,均为NOV GⅡ,占检出NOV基因型总数的75%(6/8),较其他基因型的差异有统计学意义(P<0.05),其余基因型为GⅡ.6、GⅡ.17。检测的NOV GⅡ.4与世界流行株GⅡ.4/2006(CQ845367)在同一分支,相似性达96%,有高同源性。NOVGⅡ.6/2019和参考株AJ277620在同一分支,NOVGⅡ.17/2019和参考株KU663020在同一分支,相似性为99%,均有高同源性,无变异株。研究结论:1、我们建立了可以同时、快速检测NOV GⅠ和GⅡ、A组RV、SaV、HAdV和HAstV的多重qRT-PCR的技术,选取临床诊断为急性胃肠炎121例患者粪便样本,检出上述病毒阳性样本36例。2、镇江部分地区 NOV感染以GⅡ感染为主,具有明显的李节、年龄段分布特征,GⅠ的感染仅有季节分布特征。A组RV感染具有季节、年龄段分布特征。3、未成年组急性病毒性胃肠炎发病率显著高于成年组。急性病毒性胃肠炎患者无性别上的差异。急性病毒性胃肠炎患者均出现了腹泻症状,其次较常见的症状为恶心呕吐。4、镇江地区NOV GⅡ存在GⅡ4、GⅡ6、GⅡ 17三种基因型,主要流行为GⅡ.4基因型,与世界流行株GⅡ.4/2006(CQ845367)相似性为96%;NOVGⅡ.6/2019和参考株AJ277620,NOVGⅡ.17/2019和参考株KU663020,相似性均为99%,均有高同源性,无变异株。