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猪输血传播病毒（Porcine transfusion transmitted virus, PTTV）或（Porcine torque teno virus, PTTV）分为两个基因型PTTV1和PTTV2。目前PTTV1和PTTV2对猪的致病性尚不清楚。有研究显示,PTTV可能与猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）感染猪引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征有一定协同致病作用,因为这两种病毒常以混合感染形式流行。为了解我国猪群中PTTVs与PCVs混合感染情况,采用PCR法对来自14个省份280份病料进行了检测,结果PTTV1与PTTV2阳性检出率分别为51.8%和28.2%,PTTV1和PTTV2混合感染率为18.2%;PCV1与PCV2阳性率分别为41.1%和37.5%,PCV1和PCV2混合感染率为19.6%;PCV2阳性样品中PTTV1和PTTV2混合感染率达到75.0%。此外,对2株PTTV1基因组克隆测序,与GenBank中的6个PTTV1序列比对,结果相似性为67.3%～95.1%;对4株PTTV2基因组克隆测序,与GenBank下载的4条PTTV2序列比对,其相似性为84.7%～90.4%;PTTV1与PTTV2之间序列比对,其相似性仅为44.0%。PTTV1和PTTV2基因高变区分别位于520 nt～2594 nt和720 nt～2170 nt区间。表明我国猪群中有PTTV与PCV2混合感染存在,两种病毒混合感染引起的相关疾病可能存在一定依存度;PTTV1和PTTV2基因型变异幅度较大,具有遗传变异多样性。PTTV1和PTTV2基因组结构相似,有3个大的开放阅读框（Open reading frames, ORFs）（ORF1、ORF2和ORF3）,其中ORF1被认为是编码病毒壳体蛋白（Cap）的基因,ORF2编码可能病毒复制酶相关蛋白（Rep）,ORF3编码蛋白与细胞凋亡有关。由于Cap蛋白为病毒主要结构组成蛋白,能够刺激机体产生体液和细胞免疫反应,是建立检测诊断方法的理想靶抗原。为了开展该病毒血清学诊断方法的建立,本研究对PTTV2的ORF1基因进行扩增,并克隆至pGEX6p-1载体中构建重组质粒pGEX -PTTV2-ORF1。将重组质粒转化至Rosetta（DE3）感受态细胞,以终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导表达,获得PTTV2-Cap重组蛋白,分子量约82 kDa,重组蛋白,以包涵体形式存在。用抗GST单抗进行Western-blot鉴定,表明该重组蛋白表达成功,为下一步开展该病毒诊断技术的研究奠定了基础。鉴于原核表达系统不能对编码的蛋白质进行正确加工和折叠等缺点,而真核表达系统能克服这一缺点的优势,本研究将PTTV2-ORF1基因插入到pBlueBac4.5/V5-His TOPO TA载体,分别构建了PTTV2-ORF1全长序列（pBlueBac4.5/V5-His-PTTV2-ORF1-F）和截短的N端ORF1部分序列（pBlueBac4.5/V5-His-PTTV2-ORF1-S）的重组质粒。将上述2种重组质粒与Bac-N-BlueTM DNA共转染昆虫细胞（Sf21）,经3次病毒蚀斑克隆,获得了2株重组杆状病毒,分别表达全长和截短的TTV2 Cap（rBlueBac-PTTV2-ORF1-F和rBlueBac-PTTV2-ORF1-S）。重组杆状病毒毒种接种昆虫细胞进行重组蛋白表达,优化表达条件,用SDS-PAGE和Western blot鉴定表明,表达的全长和截短重组蛋白分子质量分别为79 kDa和43 kDa。在重组蛋白C末端设计了6×His-Tag标签,采用Ni2+亲和层析法进行了蛋白纯化。本研究为该病毒血清抗体检测和疫苗免疫的研究奠定了基础。迄今为止,尚未见有PTTV在体外分离成功的报道。为了获得PTTV2毒株,本研究采用感染性分子克隆技术,克隆PTTV2全长基因组,经酶切和自我环化操作获得感染性克隆,采用脂质体法将环化的病毒基因组转染猪睾丸细胞系（ST）和猪肾细胞系（PK15）,对拯救的病毒进行细胞传代,取各代次培养物进行PCR检测,第1～6代培养物病毒核酸检测结果均呈阳性,但第7～9代核酸检测结果呈阴性,推测ST和PK15细胞系可能不适于该病毒的增殖。
