弱光下番茄抗病性变化中质外体葡萄糖信号的作用及机制研究

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近年来,我国设施蔬菜产业蓬勃发展,其中番茄是我国重要的蔬菜经济作物。但是全球气候变化带来的极端天气使得在番茄实际生产中频繁遭受非生物以及生物逆境,造成巨大的经济损失。设施覆盖遮阴、阴雨天气、以及近年来的雾霾多发等带来的设施弱光问题常导致番茄生产上病害高发频发,尤其是由Pseudomonas syringae pv.tomato(Pst)DC3000引起的番茄细菌性叶斑病,危害大且防控难。生产中主要依赖化学农药来进行病害的防控,严重威胁着我国食品安全和生态环境。本文解析了番茄植物细胞通过RGS1(Regulator of G protein signaling)/G蛋白复合体感知并传导质外体葡萄糖信号调控弱光下番茄对Pst DC3000的抗性的路径,以及发现了一个具有非生物/生物逆境抗性的NAC转录因子SlNAP1。主要研究结果包括以下几点:1.针对弱光下番茄植物抗病性降低的机制不清楚的问题,我们发现了质外体葡萄糖信号在弱光下番茄抗病性变化中具有重要的作用。与正常光(光照强度为300μmol m-2 s-1)相比,弱光(光照强度为50μmol m-2 s-1)显著降低了番茄对Pst DC3000的抗性。正常光和弱光条件下接种Pst DC3000后通过测定番茄叶片质外体葡萄糖和总葡萄糖的含量,发现在弱光下或者接种Pst DC3000后,番茄叶片质外体葡萄糖和总葡萄糖含量显著降低。其中,番茄叶片质外体葡萄糖减少的更为显著,在弱光下接种Pst DC3000后降低了91.7%,而叶片总葡萄糖含量只减少了40.9%。此外,我们发现外源处理葡萄糖显著增强了弱光下番茄对Pst DC3000的抗性。这些数据表明质外体葡萄糖可能作为信号分子,在弱光下番茄对Pst DC3000的抗性中起着关键的作用。2.拟南芥AtRGS1被认为可以感知细胞外葡萄糖,但是缺乏RGS1和葡萄糖结合的直接证据,我们发现在细胞层面上番茄RGS1可以直接结合葡萄糖,并且RGS1负调控抗病性,且是弱光下葡萄糖诱发防御反应所必需的。我们以拟南芥AtRGS1(At3g26090)蛋白的氨基酸序列作为查询序列通过序列比对方法鉴定了番茄Sl-RGS1基因(Solyc05g014160)。通过烟草瞬时过表达RGS1-GFP蛋白来鉴定RGS1的亚细胞定位,发现番茄RGS1定位于细胞膜上。通过基于细胞的生物膜干涉法(Cell-based biolayer interferometry assay)发现番茄RGS1特异性结合葡萄糖。并且激光共聚焦显微镜成像显示,葡萄糖以浓度和时间依赖性方式诱导RGS1蛋白发生内吞作用。通过构建rgs1基因编辑突变株系,我们发现番茄RGS1负调控番茄对Pst DC3000的抗性,并且葡萄糖增强弱光下番茄植株抗病性的效果在rgs1突变体材料中被严重削弱。3.葡萄糖信号的感知和传导是密不可分地,通常RGS1与G蛋白偶联,以介导糖信号传导。我们发现番茄RGS1与G蛋白复合体一起感知并传导质外体葡萄糖信号调控弱光下番茄植物的抗病性。我们鉴定了番茄G蛋白家族,发现番茄基因组编码6个Gα亚基基因(1个典型的Gα亚基基因GPA1,5个ExtraLarge G protein亚基基因),1个Gβ亚基基因AGB1,4个Gγ亚基基因。通过荧光双分子互补Bi FC和荧光素酶互补Split-Luc方法,我们发现RGS1与GPA1互作,GPA1与AGB1互作,而未检测到RGS1与AGB1的互作。外源葡萄糖处理可以削弱RGS1-GPA1,GPA1-AGB1的互作强度。通过构建gpa1、agb1突变体材料,我们发现番茄GPA1在弱光下负调控番茄对Pst DC3000的抗性,而番茄AGB1作为正调控因子参与番茄植株的抗病性。葡萄糖在弱光条件下可以显著增强番茄野生型材料对Pst DC3000的抗性,然而这一葡萄糖诱导的抗病性的效果在上述突变体材料中均受到严重削弱。研究发现番茄GPA1和AGB1可能在RGS1的下游传导质外体葡萄糖信号调控弱光下番茄对Pst DC3000的抗性。4.位于细胞核中的转录因子可以通过调控下游靶标基因的表达来介导糖信号的功能,我们在番茄G蛋白β亚基agb1突变体材料里发现了一个基因表达量显著下调的NAC转录因子SlNAP1,并且发现SlNAP1调控非生物/生物逆境的抗性。通过在烟草中瞬时表达SlNAP1-GFP蛋白,我们发现SlNAP1定位于细胞膜上和细胞核里。通过构建SlNAP1过表达转基因株系,我们发现S1NAP1过表达株系比野生型材料矮小。并且SlNAP1过表达株系显著增强了番茄对细菌性叶斑病以及青枯病的抗性以及提高了番茄植株的耐旱性。对不同激素含量的分析表明,SlNAP1过表达株系中赤霉素(Gibberellins,GA4)含量降低,而水杨酸(Salicylic acid,SA)和脱落酸(Abscisic acid,ABA)含量升高。此外,凝胶迁移检测实验EMSA和染色质免疫共沉淀Ch IP-q PCR分析表明,SlNAP1直接靶标SlGA2ox3,SlPAL3和SlNCED1。研究发现SlNAP1可能通过抑制GA4积累以及促进SA和ABA的生物合成,来调控番茄植物的生长与非生物/生物逆境抗性。综上,本研究解析了番茄植物细胞可以通过RGS1/G蛋白信号感知并传导质外体葡萄糖信号以调控番茄弱光下的抗病性;鉴定了一个重要的番茄NAC转录因子S1NAP1正调控番茄对细菌性叶斑病、青枯病以及干旱逆境的抗性。本文研究了番茄植物面对非生物/生物多种逆境如何激发其自身抗性,为农业生产上发展出绿色环保安全的增强作物广谱逆境抗性的方法提供了参考。
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