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维生素D（vitamin D,VD）的重要功能是提高血浆钙和磷的水平,使其达到超饱和的程度,以满足骨骼矿物化的需要。25-羟基-维生素D3（25-OH-VD3）的含量则是评价人体营养状况的重要指标。大肠杆菌O157:H7是一种食源性致病菌,致病剂量低,常引起人腹痛以及出血性腹泻等。基于抗体识别的免疫检测方法具有特异性好,检测时间短等优点,被广泛应用于各种待检物的检测。然而,为了实现灵敏快速检测,需要进一步提高免疫检测方法的灵敏度。酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）是基于抗原抗体特异性识别的免疫检测方法。基于不同性能参数的抗体建立的ELISA方法灵敏度差别很大。因此,通过对抗体进行多方面评价,筛选出优良的抗体建立ELISA方法,将有助于从源头上提高检测方法的灵敏度。在本文第二章中对18种抗25-OH-VD3单克隆抗体的亚型、半抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC50)和亲和力常数（Affinity constant,Ka）等性能参数进行综合评价。筛选出了3种Ka>2.3L/moL且IC50<30ng/mL的抗25-OH-VD3单克隆抗体（3-8-D3、3-8-H5和3-8-C1）,建立ELISA方法。结果显示,基于这3种抗体的ELISA方法的灵敏度均小于10ng/mL。其中,基于抗体3-8-C1的ELISA方法是最灵敏的（0.93 ng/mL）,灵敏度明显优于基于抗体3-8-H5和基于抗体3-8-C1建立的ELISA方法（7.69ng/mL和7.53ng/mL）。基于抗体3-8-C1的ELISA方法的加标回收率（100.8%-119.3%）也明显优于两种方法（73.5%-101.8%和52.7%-71.3%）。综上所述,我们筛选到抗体3-8-C1,建立了高灵敏度的25-OH-VD3 ELISA检测方法。杂交链式反应（Hybridization chain reaction,HCR）是一种有效的信号放大策略,常被用于检测mRNA和DNA。然而传统的HCR常具有较强的背景,导致方法不够灵敏。为了提高检测灵敏度,在本文第三章中,我们设计了一种基于静态淬灭（contact quenching,CQ）和荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer,FRET）的低荧光背景发卡（CQ-FRET发卡）。通过巧妙地运用淬灭剂和FRET,使得非特异性信号的产生条件变的更严格。将设计的CQ-FRET发卡与另外两种常见的发卡（CQ发卡和FRET发卡）进行对比。结果显示,基于CQ-FRET发卡的信号放大的信噪比（37.02）明显高于基于CQ发卡（21.45）和FRET发卡（4.62）的信噪比。基于CQ-FRET发卡所建立的检测大肠杆菌O157:H7的免疫-HCR方法（2.2×101 CFU/mL）比基于CQ发卡（2.45×103 CFU/mL）和基于FRET发卡（4.85×104 CFU/mL）所建立的免疫-HCR方法更灵敏。综上所述,我们成功建立了低背景、高灵敏的免疫-HCR方法检测大肠杆菌O157:H7。