红色诺卡氏菌发酵条件优化及N-CWS提取工艺的改进研究

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目前,肿瘤及许多疾病已成为威胁人类健康的重大隐患。有研究表明,红色诺卡氏菌细胞壁骨架中的提取物具有调节机体免疫的功能,能增强T细胞、巨噬细胞、NK细胞的活性,对于人体淋巴细胞则具有致有丝分裂原活性,并能诱导机体产生干扰素。通过多年的实验及临床研究证明它具有抗肿瘤作用,并能抗细菌、病毒的感染。在临床治疗肿瘤及妇科相关疾病上有很好的疗效。如今关于N-CWS的研究大多着重于临床上针对其对癌症、炎症的抑制作用进行尝试,而关于红色诺卡氏菌的培养条件优化的研究还停留在较低水平。本研究通过对培养基中的碳源、氮源、无机盐离子、培养基pH值、摇床速度、培养温度、溶氧和接种量等因素进行了优化,通过一系列实验得出较为适合红色诺卡氏菌生长繁殖的培养方式,当培养条件为葡萄糖/酵母膏培养基,pH7-8,26℃摇床培养(320 r/min),50 mL液体培养基接种量在1.5%(0.75 mL)时最为适合。当前,对于红色诺卡氏菌的细胞壁破碎有不同的方法,本文比较了超声波法、自溶法和碱法对Nocardia的破碎情况.试验结果表明,这三种细胞壁破碎方法中超声波法和碱法周期短,效果好;而自溶法周期长效率低,效果不佳。在超声波破碎法中全程破碎时间和输出功率是超声波法破碎的主要影响因素,采用短时多次的破碎方式和质量浓度为1.5 g/L的细胞悬浮液有利于细胞的破碎。同时利用正交法对超声波破壁的条件进行研究,得出在一定菌浓下,用于超声波破壁的最佳设置为超声波时间15s,间隔时间15s,循环数40次,功率500W。在自溶法破碎中,自溶时间是主要影响因素,NaCl质量分数为1%、温度为50℃利于细胞的自溶,经过较长时间的处理时间,10%的NaCl及pH9的液体环境利于自溶。碱液(KOH溶液)浓度为5.5%时最有利于放线菌细胞破壁,破壁时间为30分钟。传统的红色诺卡氏菌细胞壁骨架(N-CWS)成品检测中存在某些不足,本实验通过以下三方面的改进来提升检测水平。用薄层层析法来代替纸层析法并研究影响层析的一些因素,寻得最佳的层析分离效果,使二氨基庚二酸鉴定实验更为明确;同时寻求阿拉伯糖和葡萄糖标准曲线之间的规律性,用葡萄糖来代替阿拉伯糖制作标准曲线进行细胞壁糖含量测定,节约成本;用分光光度计测成品在甲醇的光吸收峰有无吸收峰代替辨色法以使甲醇残留量检测更为可靠。
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