β-葡聚糖酶产生菌的选育、发酵条件优化及酶纯化的研究

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β-葡聚糖酶作为添加剂己应用于饲料和啤酒工业中。β-葡聚糖酶作为生物活性多糖的改良剂及分析组成与结构的工具酶,也得到了广泛应用。另外,近年来发现β-葡聚糖酶在植物的防病和抗病中也具有非常重要的作用。   本论文通过平板初筛和摇瓶复筛,从土壤中筛选出一株β-葡聚糖酶产生菌MT-7,并发现其具有分解代谢物阻遏效应。经过形态学和分子生物学鉴定,该菌株为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)。   对菌株MT-7进行原生质体诱变,发现该菌株原生质体最佳制备条件为:原始菌株培养14h,以纤维素酶、溶菌酶和蜗牛酶质量体积比5:3:2的比例配制复合酶液,在30℃条件下酶解3.5h,可得原生质体6.8x107个/mL。以90s为紫外照射时间,经诱变选育后,突变菌株UV-26的酶活提高到3.4U/mL,比原始菌株MT-7提高了2.25U/mL,提高了1.96倍。   对突变菌株UV-26培养基组分进行单因素实验和正交优化实验,发现最佳组成为(%,w/v):茯苓粉3.0,麸皮2.0,酵母膏1.2,脲0.3,KH2P040.2,MgS04·7H200.1,FcS04·7H200.1,无水CaC120.5。最佳发酵条件为:种子培养时间为24h,初始pH为4.0,培养温度为30℃,接种量为3%,装液量为50mL/250mL,转速为160r/min,培养时间为72h。经过培养基组分和发酵条件优化后,菌株UV-26的酶活由原来的3.4U/mL提高到6.51U/mL,提高了0.91倍。   菌株UV-26经过乙醇分级沉淀、透析浓缩和离子交换层析,得到电泳纯的β-葡聚糖酶,通过变性凝胶电泳和非变性凝胶电泳结果推测:纯化出来的β-葡聚糖酶是一个等分子量双亚基结构的聚合体,分子量约为200KDa。纯化后的p一葡聚糖酶酶活回收率为28.7%,纯化倍数为24倍。   纯化的β-葡聚糖酶最适反应pH值为6.0、pH稳定范围为5.0-7.0,最适反应温度为55℃,在低于50℃时,酶活具有较好的稳定。Ca2+有一定的促进作用,Fe2+对该酶具有部分抑制作用,Fe3+和Mn2+则具有明显的抑制作用,Hg2+对β-葡聚糖酶具有强烈的抑制作用。该酶动力学方程为y=0.0355x+0.2219(R2=0.9939),米氏常数Km值为159.98ug/mL,最大反应速率Vm值为4.51mg/mL-min。
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