食管癌是我国最常见的消化道肿瘤之一。虽然随着外科、麻醉、围手术期处理以及重症监护条件和技术取得较大的提高,但是单纯手术治疗效果仍不理想。其原因在于食管癌发生和发展的分子机制目前仍不清楚,导致食管癌疗效欠佳。肿瘤细胞代谢异常是肿瘤细胞显著区别于正常细胞的显著特征之一。从肿瘤代谢的角度寻找食管癌的治疗靶点很可能为食管癌的治疗带来新的希望。甲羟戊酸(MVA,Mevalonate)途径除了终产物胆固醇外,还能产生许多中间代谢产物,如类异戊二烯,泛醌等。这些物质在细胞重要的生理过程中发挥作用。甲羟戊酸代谢途径在食管鳞癌发生中的功能目前仍不清楚。在本研究中,我们克隆了甲羟戊酸代谢限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase,HMGCR),并对其进行了功能和所涉机制的初步研究。在本研究中,我们收集食管鳞癌组织标本,培养食管鳞癌细胞系,利用荧光定量PCR检测食管鳞癌组织及其配对的正常组织中HMGCR的mRNA水平,利用蛋白印迹检测食管鳞癌组织和食管鳞癌细胞中HMGCR的蛋白水平。在细胞水平上,我们通过脂质体转染食管鳞癌细胞,建立过表达HMGCR的食管鳞癌稳定细胞株;设计RNA干扰序列,下调HMGCR在食管鳞癌细胞中的表达。我们利用MTT实验、Boyden Chamber和软琼脂集落实验分析HMGCR对食管鳞癌细胞生长、迁移和克隆形成的影响;利用GST-pull down和蛋白印迹检测HMGCR对Ras-ERK信号通路的活化作用。最后,我们在食管鳞癌细胞中过表达或下调c-Myc的表达,通过荧光定量PCR和蛋白印迹检测c-Myc的表达对HMGCR mRNA和蛋白水平的影响。我们的研究结果显示,与正常食管粘膜组织相比,HMGCR在食管鳞癌组织中的mRNA水平和蛋白水平均呈现上调趋势。HMGCR在食管鳞癌细胞株中的表达水平高于永生化的食管粘膜上皮细胞。在食管鳞癌细胞Eca109和正常食管粘膜细胞SHEE中过表达HMGCR促进食管鳞癌细胞生长、迁移和在软琼脂上克隆集落;在食管鳞癌细胞Eca109和Caes-17中下调HMGCR的表达抑制食管鳞癌细胞迁移和在软琼脂上克隆集落。在分子机制研究中,我们发现hmgcr过表达促进ras活化,上调erk磷酸化水平。在食管鳞癌细胞中,我们发现代谢的重要调控因子c-myc上调hmgcr的mrna水平和蛋白水平。综上所述,我们的研究结果提供了充分的证据,证明hmgcr在食管鳞癌发生发展过程中的重要功能。同时,我们的研究也提示hmgcr的抑制剂他汀用于食管鳞癌治疗的可能性。本研究可以分为如下三个部分:第一部分hmgcr在食管鳞癌组织和食管鳞癌细胞中表达上调目的:研究hmgcr在食管鳞癌组织及配对的正常组织、食管鳞癌细胞株中的表达模式。方法:首先利用荧光定量pcr(real-timepcr)检测hmgcr在40例食管鳞癌组织及配对的正常组织中的mrna水平;使用蛋白印迹法,检测随机挑选的6例食管鳞癌组织及配对的正常组织中hmgcr的蛋白水平,验证荧光定量pc结果;最后,利用蛋白印迹检测正常食管上皮细胞和食管鳞癌细胞中hmgcr的蛋白水平。结果:mrna水平的检测结果显示,食管鳞癌组织中hmgcr的mrna水平较配对的正常组织显著升高;蛋白印迹实验结果表明,食管鳞癌组织中hmgcr的蛋白水平较配对的正常组织显著上调,这一结果与荧光定量pcr的结果一致;最后,对多种食管鳞癌细胞和正常食管上皮细胞的蛋白印迹结果显示,hmgcr在正常食管上皮细胞中的表达水平较低,在食管鳞癌细胞中的表达水平较高。结论:在食管鳞癌组织和细胞系中,hmgcr的mrna水平和蛋白水平均有较强的表达。与正常组织相比较,食管鳞癌组织中hmgcr的表达水平上升;与正常食管上皮细胞相比,hmgcr在鳞癌细胞中的表达水平升高。这些结果提示hmgcr在食管鳞癌发生发展过程中很可能起着非常重要的作用。第二部分hmgcr对食管鳞癌细胞生长、迁移和克隆集落的影响目的:研究hmgcr对食管鳞癌细胞恶性行为(如生长、迁移、克隆集落等)的影响,揭示hmgcr在食管鳞癌进展中的功能。方法:利用脂质体转染hmgcr的表达载体(myc-hmgcr,带myc标签)至食管鳞癌细胞eca109和正常食管上皮细胞shee中;通过mtt法检测hmgcr对食管鳞癌细胞eca109和正常食管上皮细胞shee生长的影响;通过软琼脂集落法研究hmgcr对食管鳞癌细胞克隆形成能力的影响;借助于细胞迁移模型揭示hmgcr对食管鳞癌细胞eca109和正常食管上皮细胞shee迁移的影响。同时,制备hmgcrrna干扰的病毒载体,在食管鳞癌细胞eca109、caes17中下调hmgcr的表达;利用软琼脂集落法揭示下调hmgcr的表达对食管鳞癌细胞克隆形成的影响;借助细胞迁移模型研究hmgcr表达下调对食管鳞癌细胞迁移能力的影响结果:通过脂质体介导的稳定转染,在食管鳞癌细胞eca109和正常食管上皮细胞shee中建立了稳定表达细胞株,过表达带myc标签的hmgcr。mtt实验结果表明,稳定表达hmgcr促进食管鳞癌细胞eca109、正常食管上皮细胞shee的生长;细胞迁移实验显示,hmgcr在eca109和shee细胞中的表达增加食管鳞癌细胞的运动能力;软琼脂集落形成实验显示,hmgcr在eca109细胞中的表达促进其非锚定性生长。此外,我们构建了hmgcrrna干扰的慢病毒载体,非常有效地干扰hmgcr在食管鳞癌细胞eca109和caes17中的表达。细胞迁移实验表明,hmgcr表达下降削弱了食管鳞癌细胞eca109和caes17的运动能力;克隆集落形成实验显示,干扰hmgcr的表达使食管鳞癌细胞的非锚定性生长的能力受到抑制。结论:hmgcr促进食管鳞癌细胞的生长、迁移、克隆形成能力,干扰hmgcr的表达抑制食管鳞癌细胞非锚定性生长和迁移。hmgcr对食管鳞癌的进展发挥促进作用。第三部分hmgcr在食管鳞癌细胞中激活ras-erk信号通路目的:研究hmgcr调控食管鳞癌细胞恶性行为(如生长、迁移和克隆集落)的分子机制。方法:利用gst-pulldown平台,研究hmgcr的表达ras的活化作用及对erk磷酸化水平的影响;通过荧光定量pcr和蛋白印迹,检测c-myc基因的表达对hmgcr的mrna水平和蛋白水平的影响。结果:GST-pull down分析显示,过表达HMGCR促进Ras的活化,上调ERK的磷酸化水平。干扰HMGCR的表达抑制ERK的磷酸化。荧光定量PCR和蛋白印迹的实验结果显示,过表达c-Myc上调HMGCR的mRNA水平和蛋白水平,干扰cMyc的表达抑制HMGCR的mRNA水平和蛋白水平。结论:HMGCR在食管鳞癌细胞中激活Ras-ERK信号通路,代谢调控的关键分子c-Myc调控HMGCR的表达。